Clonagem e expressão de provável serino protease extracelular de Chromobacterium violaceum em Escherichia coli

• Autor(a) principal: Fachinelli, Natália Pezzi
• Data de Publicação: 2006
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/159463
• topic: Chromobacterium violaceum; Serino-proteases; Clonagem

Chromobacterium violaceum é uma bactéria gram-negativa de hábito saprófito, que vive em solos e águas de regiões tropicais e subtropicais, sendo que no Brasil é encontrada abundantemente nas águas do Rio Negro (Amazônia). Essa bactéria apresenta grande potencial para aplicações nas áreas de saúde, ecologia e indústria. Entre as potenciais aplicações encontram-se a produção de plásticos biodegradáveis, limpeza de áreas poluídas com metais pesados e acúmulo de partículas de ouro em áreas de mineração em processo livre de mercúrio. A partir do seqüenciamento completo do genoma de C. violaceum (GenBank AE016825), realizado pela Rede Nacional do Projeto Genoma Brasileiro, surgiram muitas perspectivas para o entendimento deste organismo e seu potencial biotecnológico. Para a realização deste trabalho foi selecionada uma seqüência codificadora de interesse para a expressão em Escherichia coli: CV2717 -provável serino protease extracelular. A partir do DNAgenômico de C. violaceum ATCC 12472, a CDS de cv2717 foi amplificação porPCR e clonada em blunt no vetor de expressão pGEX-4T2. A expressão da proteína recombinante, na forma de fusão com glutationa-S-transferase (GST), se deu em condições de multiplicação celular a 37°C e de indução com 0,1 mM de IPTG por 3 h. Devido a expressão da proteína recombinante na fração insolúvel, diversas tentativas de solubilização foram testadas. A proteína recombinante foi visualizada na fração solúvel quando expressa na cepa AD494 de E. co li, após a utilização de detergentes sarcosil e Triton X-1 00. A proteína recombinante produzida será utilizada em ensaios funcionais para verificar a atividade de protease e posterior caracterização estrutural.