Diversidade genética de lactobacilos isolados de dentina cariada antes e após selamento

• Autor(a) principal: Dalalba, Raquel Soares
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/102482
• topic: Cárie dentária; Dental caries; Dentin; Lactobacillus spp; Genetic diversity; AP-PCR

Existe hipótese de que haja seleção de bactérias abaixo das restaurações devido a escassez de nutrientes. Por isso o objetivo do trabalho foi avaliar o efeito do selamento de lesões dentinárias de cárie sobre a diversidade genotípica de Lactobacilos utilizando a técnica de AP-PCR. Dezoito pacientes com lesões dentinárias em terço médio de dentina foram submetidos à remoção parcial de tecido cariado e selamento da cavidade por 3 meses. Amostras de dentina foram obtidas antes e após o selamento e cultivadas em Ágar Rogosa, por 72 horas em anaerobiose. Até sete cepas de cada tipo morfológico foram selecionadas e armazenadas em caldo de Brain Heart Infusion (BHI) e glicerol (15%) em -20º C. As amostras foram analisadas quanto à coloração de Gram e morfologia. Somente bacilos e cocobacilos gram-positivos foram mantidos na amostra. Os isolados foram também identificados pelo sequenciamento dos genes pheS/rpoA. Do total de 18 pacientes, seis apresentaram crescimento de Lactobacilos antes e após selamento. Assim, a amostra final foi de 93 isolados (44 antes do selamento e 49 depois do selamento). Para a avaliação da diversidade genética, os isolados foram replicados em BHI ágar, cultivadas por 24 horas a 37ºC . Para extração do DNA as colônias foram suspensas em 50μl de água ultrapura estéril. A técnica de AP-PCR foi realizada utilizando o primer OPA3. Lactobacillus ATCC (L. rhamnosus ATCC 7469) água ultrapura foram utilizadas como controle positivo e negativo, respectivamente. Os produtos de AP-PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 1%, corado com SybrGreen 1.6%, a 96 V durante 4 h. As imagens dos géis de AP-PCR foram capturadas por uma câmera digital (Canon Inc., Tóquio, Japão) e armazenadas no formato de arquivo de imagem para análise visual. Na análise dos amplicons, os Lactobacilos do mesmo paciente antes e depois do selamento foram sempre analisados no mesmo gel. Dois examinadores cegos e calibrados realizaram a análise visual. Um total de 43 genótipos distintos foi identificado. Teste t-pareado foi utilizado para comparar a media do número de genótipos encontrados antes e depois do selamento considerando 5% de significância. A média do número de genótipos por paciente foi de 5,17±5,49 e 2,67±2,25 (p=0,344) antes e depois do selamento, respectivamente. O menor número de bandas obtidas pela análise dos géis de AP-PCR foi 2 e o maior foi 15. A média de número de bandas foi 8.72±2.22. Um total de 31 e 16 genótipos diferentes foram encontrados antes e depois do selamento, respectivamente. Houve uma tendência de diminuição da diversidade de Lactobacilos após o período de selamento.