Clonagem, expressão e purificação de elF2 beta humano e produção de soro policlonal anti-elF2 beta

• Autor(a) principal: Carlessi, Rodrigo Maron
• Data de Publicação: 2006
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/275350
• topic: Sintese proteica : Bioquimica; Clonagem; Expressão gênica; Biologia molecular

A síntese protéica é um processo essencial à célula e envolve centenas de macromoléculas. A ausência ou a perturbação da função de qualquer um dos componentes no sistema de tradução podem causar danos à integridade e funcionamento celular. O fator eucariótico 2 de iniciação da tradução (elF2) apresenta um papel-chave no processo de tradução do mRNA e na sua regulação, promovendo a ligação do Met-tRNAi à subunidade ribossomal 40S, em um processo dependente de GTP, e fazendo a seleção do códon AUG no mRNA para início de tradução. O elF2 é um heterotrímero formado pelas subunidades alfa, beta e gama. Na porção amino-terminal da subunidade beta, existe um domínio bastante marcante composto por três blocos de seis a oito resíduos de lisina altamente conservados evolutivamente, que são responsáveis pela ligação de elF2 ao mRNA e a outros dois fatores de iniciação, elF5 e elF2B. Dados não publicados de Laurino JP mostram, em ensaio de curva de crescimento de S. cerevisiae, que o gene desprovido dos blocos de lisina competindo com o gene selvagem, sob controle do mesmo promotor, é capaz de induzir parada do crescimento celular. A partir disso, vem-se sugerindo a forma truncada do gene de elF2 beta humano como um candidato à terapia gênica direcionada principalmente ao tratamento de tumores. Atualmente, o potencial de inibição da síntese protéica através da expressão de elF2 beta truncado está sendo avaliado em nosso laboratório, com experimentos realizados em células de mamíferos em cultivo. Através de uma análise de expressão gênica nessas células será possível correlacionar a presença celular de elF2 beta truncado com o fenômeno de parada do crescimento celular. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma ferramenta imunológica para detecção por “Western-Blot” da expressão das formas selvagem e truncada de elF2 beta. Para isso, a região codificadora (CDS) de elF2 beta humano foi clonada em vetores de expressão em procariotos, a proteína recombinante foi produzida em E. coli, purificada e utilizada na imunização de um coelho Nova Zelândia, que produziu um soro policlonal anti-elF2 beta recombinante. Tal soro foi avaliado quanto ao seu potencial para a detecção da expressão de elF2 beta em extratos de células de mamíferos.