Desenvolvimento de ferramentas para a construção e análise de mutantes funcionais no fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae

• Autor(a) principal: Penteriche, Augusto Bartz
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/238192
• topic: Controle biológico; Controle de pragas; Fungos; Metarhizium anisopliae

O gênero Metarhizium é composto por fungos entomopatogênicos de elevada importância, como Metarhizium anisopliae, e são extensivamente utilizados para o controle de artrópodes praga como Helicoverpa armigera e Spodoptera frugiperda, ambas pragas de diversas culturas como milho, soja e algodão há mais de cem anos. Atualmente, esporos de Metarhizium spp. compõe mais de um terço de todas formulações fúngicas comerciais para o controle biológico. Ainda assim, estas formulações carecem de eficiência quando comparadas ao controle químico. Para mudar este cenário, diversas abordagens estão sendo empregadas, como o estudo de determinantes de virulência e a engenharia genética para a obtenção de linhagens melhoradas para o controle biológico. No entanto, a escassez de ferramentas moleculares padronizadas aplicáveis aos fungos utilizados em controle biológico atrasa o desenvolvimento de linhagens competitivas, e dificulta o estudo do impacto, disseminação e evolução que esses organismos terão na natureza. A fim de ampliar o repertório de ferramentas moleculares para se trabalhar com M. anisopliae, foi construído, no presente trabalho, um cassette para a expressão do sistema repórter Katushka, uma proteína fluorescente far-red de alto brilho, sob o controle do promotor forte gpdA e terminador TrpC de Aspergillus nidulans, o qual foi transformado em M. anisopliae. Katushka é conhecido por ser um sistema eficiente de gene-reporter para técnicas de imageamento in vivo, e ainda não havia sido padronizada para M. anisopliae. Essa construção demonstrou ser geneticamente estável e sua fluorescência pôde ser detectada em besouros adultos de Ulomoides dermestoides após o ciclo completo de infecção de M. anisopliae expressando Katushka. Ainda, a expressão de Katushka em M. anisopliae não influenciou na sua virulência em um bioensaio com larvas de Tenebrio molitor, característica importante para que um gene-reporter possa ser usado em diversos estudos que enfoquem o processo de infecção. A escassez de promotores endógenos descritos em M. anisopliae limita as opções para as análises em nível molecular. Assim, Katushka foi usada como repórter para o screening de sequências promotoras de diferentes tamanhos encontradas à montante dos genes β-tubulina, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gpdMa), gamma-actina e trp1 de M. anisopliae. As construções de 1.000 pb e 500 pb da β-tubulina foram capazes de produzir níveis de fluorescência similares quando comparadas ao promotor padrão PgpdA. As construções de PgpdMa não se mostraram eficientes. Não foram obtidos mutantes para as construções dos promotores da gamma-actina e trp1 nos screenings realizados. Pesquisas adicionais são necessárias para aferir estatisticamente a eficiência desses promotores, bem como os elementos genéticos presentes em suas sequências. Este trabalho resultou na construção de modelos eficientes para estudos moleculares em M. anisopliae.