Clonagem da celobiose desidrogenase 1 de neurospora crassa na levedura Pichia pastoris

• Autor(a) principal: Costa, Lucas Jorge Marianno
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRJ
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11422/15157
• topic: Enzimas; Bioquímica; Pichia pastoris; Glicosilação; Leveduras; Neurospora crassa; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA

A celobiose desidrogenase (CDH) é uma oxidoredutase extracelular produzida por fungos lignocelulolíticos e com dois domínios distintos. Um grande domínio catalítico desidrogenase (DH) contendo FAD como cofator e um pequeno domínio citocromo (CYT) contendo o cofator heme-b, conectados por uma sequência linker. Em virtude das suas propriedades catalíticas tanto em solução quanto imobilizadas em superfícies condutoras, as CDHs têm um grande potencial para o desenvolvimento de biossensores e células de biocombustíveis por causa das suas habilidades de transferência direta de elétrons (DET) quando imobilizada, além do emprego em biorremediação de compostos aromáticos e deslignificação de biomassa celulósica através da ação redutora quando em solução. A expressão heteróloga da CDH utilizando a levedura Pichia pastoris é uma alternativa para a produção em larga escala. No entanto a alta taxa de glicosilação deste hospedeiro pode impactar nas propriedades cinéticas da CDH, inclusive na DET. Portanto, o objetivo do trabalho foi produzir heterologamente a CDH recombinante selvagem, para avaliar futuramente o seu desempenho. Para isto, o fragmento sintético de DNA que compõe a sequência da CDH de Neurospora crassa (NcCDH) foi adquirido comercialmente. As construções NcCDH wt (selvagem) e o vetor pPICZαC foram então clonadas em vetor de expressão induzida por metanol e transformadas em P. pastoris. Os resultados sugerem a transformação bem sucedida da Pichia pastoris X-33 com o vetor de expressão modulável por metanol contendo o gene da CDH1. O trabalho de expressão heteróloga está em andamento com uma estratégia para aprimorar o processo de fermentação e de purificação, desta forma, irá melhorar bastante o rendimento geral na obtenção das proteínas recombinantes de interesse no futuro.