Papel das Redes Extracelulares de Neutrófilos (NETs) na modulação funcional de macrófagos infectados por Leishmania

• Autor(a) principal: Sardinha, Andrew Victor Diniz
• Data de Publicação: 2020
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRJ
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/11422/17506
• topic: Macrófagos; Leishmania; Imunomodulação; Armadilhas extracelulares; Macrophages; Immunomodulation; Extracellular traps; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::MICROBIOLOGIA; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::IMUNOLOGIA

Neutrófilos são células da imunidade inata essenciais no desenvolvimento de uma resposta imunológica protetora contra Leishmania. Além do seu papel na fagocitose deste parasito, os neutrófilos são especializados na liberação de redes extracelulares de DNA, as NETs (do inglês “neutrophil extracelular traps”), que são constituídas por cromatina associada com proteínas de diferentes compartimentos dos neutrófilos, como citoplasma e grânulos. A netose, processo celular que culmina com a liberação das NETs, ocorre logo após a interação dos neutrófilos com o parasito. Estas redes funcionam na contenção e morte dos parasitos. Entretanto, além da sua função microbicida muito bem estabelecida na literatura, já é sabido que as NETs podem modular o tipo de resposta de outras células do sistema imune. Nosso grupo, por exemplo, observou que a interação de monócitos com NETs induzidas por Leishmania amazonensis impede a diferenciação destas células em dendríticas, uma célula essencial para a montagem de uma resposta protetora. Na presença das redes, os monócitos diferenciaram-se em macrófagos com um fenótipo anti-inflamatório, favorecendo a infecção. Sendo o macrófago uma célula amplamente distribuída nos tecidos, e tendo um papel fundamental na infecção por Leishmania, sustentando a replicação intracelular do parasito, decidimos então elucidar qual seria o papel das NETs na modulação funcional de macrófagos infectados por este parasito. Os neutrófilos humanos foram obtidos do sangue de doadores saudáveis por meio da separação por gradiente de densidade e os neutrófilos murinos foram obtidos através do recrutamento com caseína seguida da lavagem da cavidade peritoneal. O sobrenadante rico em NETs foi produzido através da incubação de neutrófilos e promastigotas de Leishmania amazonensis. As NETs foram quantificadas no sobrenadante através da dosagem de DNA. Os macrófagos foram obtidos através da diferenciação da linhagem monocítica humana THP-1 com PMA, da diferenciação de monócitos humanos do sangue periférico humano (MDMs), e através da cultura de células RAW. Estes macrófagos foram infectados com promastigotas de L. amazonensis na proporção de 5:1. Em seguida, os macrófagos infectados foram tratados com diferentes concentrações de NETs e posteriormente lisados para a contagem de amastigotas viáveis na câmera de Neubauer. Em alguns experimentos, as NETs foram pré-tratadas com DNase ou foram aquecidas para desnaturas suas proteínas. Nas concentrações utilizadas em nosso estudo, as NETs não apresentaram citotoxidade para nenhum dos três tipos de macrófagos testados (RAW264,7, THP-1 e MDMs). As NETs foram capazes de ativar macrófagos murinos e humanos e de controlar a infecção intracelular por Leishmania amazonensis. Os macrófagos da linhagem THP-1 foram mais resistentes à ativação pelas NETs e, nestas células, apenas observamos menor sobrevivência dos parasitos com 500 ng/ml das redes. A ativação dos macrófagos infectados depende da integridade do arcabouço de DNA das NETs, ao menos nas células murinas. Não observamos diferenças na morte dos parasitos quando NETs que tiveram as proteínas desnaturadas foram utilizadas. Mais experimentos serão necessários para determinar os mecanismos pelos quais as NETs ativam os macrófagos infectados.