Oligonucleotídeos: desenho, produção e aplicações

• Autor(a) principal: Nunes, Allan Roberto Dias
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFRN
• Texto Completo: https://repositorio.ufrn.br/jspui/handle/123456789/23160
• topic: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA; Oligodeoxiribonucleotídeo; Síntese enzimática; Desenho de primers; Flavivírus; Vírus Zika; Vírus Dengue

Oligonucleotídeos são pequenas moléculas de ácidos nucleicos com grande potencial biotecnológico para aplicação em diversas áreas da biologia e da medicina. Entre suas principais aplicações está a identificação genética de patógenos por meio da técnica de PCR e a produção de aptâmeros com efeito bioativo ou farmacológico. Nesse contexto, a produção e o desenho de oligonucleotídeos são pontos críticos para sua aplicação. A técnica mais utilizada para a produção de oligonucleotídeos de DNA é a síntese química. Apesar de sua eficácia, esta técnica não pode ser realizada in house, tornando o usuário totalmente dependente de um fornecedor. Este trabalho teve como objetivo desenhar novos oligonucleotídeos com potencial para diferentes aplicações, desenvolver um método para produzi-los, e validar a sua aplicação em um protocolo para detecção de Flavivírus por meio da técnica de reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Na primeira etapa do trabalho, um conjunto de primers universais para identificação de Flavivírus foi desenvolvido. Para isso, 1442 genomas completos de diferentes representantes do gênero Flavivirus foram alinhados para seleção de regiões conservadas (CRs). Foram selecionadas 26 CRs, as quais permitiram o desenho de 76 primers universais. Entre eles, foi escolhido o par de primers com a melhor condição de degeneração e temperatura de anelamento para validação do protocolo de RT-PCR in vitro, o qual tem o potencial de amplificar um fragmento da proteína NS5 de 800-806 pb de tamanho. O fragmento gerado é suficientemente variável para discriminar potencialmente qualquer espécie do gênero Flavivirus por sequenciamento. Uma vez determinado o fragmento que seria amplificado para detecção universal de Flavivírus, procedeu-se uma nova etapa para desenho de primers específicos. Desta vez, o produto de amplificação gerado pelos primers universais foi definido como alvo, no intuito de produzir cinco novos primers específicos para identificação do vírus Zika e dos quatro sorotipos do vírus Dengue. Dessa forma, foi desenvolvido um sistema de semi-nested RT-PCR no qual, em um primeiro passo, é detectada a presença de qualquer espécie do gênero Flavivirus e, em um segundo passo, pela adição de um conjunto de primers específicos, é permitida à amplificação de fragmentos de tamanhos diferentes para discriminação do vírus Zika e dos quatro sorotipos de dengue em gel de agarose. Na segunda etapa do trabalho, foi desenvolvido um método enzimático para produção de oligonucleotídeos de DNA. O método proposto é baseado na rolling circle amplification (RCA) e envolve quatro etapas enzimáticas: (1) fosforilação da extremidade 5’ da sequência alvo, (2) circularização da sequência alvo, (3) polimerização de uma nova fita simples de DNA contendo os oligonucleotídeos de interesse e, por fim, (4) um ensaio de restrição para liberar os oligonucleotídeos. Todas as etapas foram realizadas em um único tubo, adicionando as enzimas com suas respectivas soluções-tampão. Os oligonucleotídeos gerados foram separados utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida 8% (PAGE) e visualizados por coloração em prata. Potencialmente, qualquer oligonucleotídeo que não tenha bases degeneradas pode ser produzido pelo método enzimático proposto em um único tubo de reação. Para ilustrar, foi apresentada a produção de três variações do aptâmero 31-TBA, um oligonucleotídeo de cadeia simples que tem ação anticoagulante.