Engenharia genômica de linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae visando melhorar a tolerância ao etanol

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Bücker, Augusto
Data de Publicação: 2014
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFSC
Texto Completo: https://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/129051
Resumo: Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014.
id UFSC_0c431dedeff58e69d52d3f324d9dfb61
oai_identifier_str oai:repositorio.ufsc.br:123456789/129051
network_acronym_str UFSC
network_name_str Repositório Institucional da UFSC
repository_id_str 2373
spelling Engenharia genômica de linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae visando melhorar a tolerância ao etanolBioquímicaSaccharomyces cerevisiaeAlcoolTese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014.Durante a produção industrial de álcool combustível, um dos fatores limitantes no processo é o estresse promovido às células de levedura pelas altas concentrações de etanol presentes no meio. Este trabalho teve por objetivo incrementar a tolerância ao etanol de uma linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae através da modificação da região promotora de dois genes: o gene TRP1 envolvido na síntese de triptofano, ou o gene MSN2 que codifica para um fator de transcrição que regula a resposta ao estresse geral em S. cerevisiae. As linhagens recombinantes foram desenvolvidas usando técnicas de engenharia genômica baseadas em PCR, para inserir o promotor forte e constitutivo PADH1 na região promotora dos genes alvo. Embora a linhagem industrial utilizada (CAT-1) seja diplóide, apenas um dos alelos do gene alvo foi modificado. Após confirmação por PCR das modificações realizadas no genoma das linhagens recombinantes, a sobre-expressão dos genes foi quantificada por qRT-PCR. Os resultados mostraram que a linhagem de levedura industrial é mais tolerante ao etanol (podendo crescer em até 14% do álcool), quando comparado com uma linhagem de laboratório (nessa última 10% de etanol inibe totalmente o crescimento). Em ambas a linhagens a sobre-expressão do gene TRP1 claramente incrementou a tolerância ao etanol. As linhagens industriais sobre-expressando o gene MSN2, ou uma versão truncada do gene (MSN2-T, sem os primeiros 48 aminoácidos), mostraram-se igualmente mais tolerantes ao etanol. A linhagem que sobre-expressa o gene MSN2 mostrou-se também mais resistente ao estresse salino, mas mais sensível ao estresse oxidativo, enquanto que a linhagem que sobre-expressa o gene MSN2-T foi mais resistente a esse último estresse. A análise dos níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio (ROS) revelou que o estresse provocado pelo etanol aumenta significativamente os níveis de ROS nas células, sendo que ocorreu uma redução na quantidade desses compostos nas linhagens modificadas no gene MSN2. Em seguida, foi investigado se essa melhora no crescimento celular na presença de altas concentrações de etanol leva a produtividades mais elevadas de etanol durante a fermentação de altas concentrações (200 g/L) de sacarose, inclusive na presença de diferentes concentrações estressantes de etanol no início das fermentações. Os resultados revelaram que não ocorreram diferenças significativas entre a linhagem industrial CAT-1 e as linhagens recombinantes nos diferentes parâmetros fermentativos analisados, tanto em processos de bateladaXsimples quanto na batelada alimentada, com reciclo celular. O estresse alcoólico afetou principalmente o consumo dos monossacarídeos (glicose e frutose) produzidos na hidrólise da sacarose. Em conclusão, os resultados sugerem que uma maior tolerância ao etanol (através das modificações genômicas realizadas neste trabalho), não significa necessariamente uma maior produção de etanol pela linhagem industrial de S. cerevisiae.<br>Abstract : During fuel alcohol industrial production, one of the limiting factors in the process is the stress promoted to yeast cells by high ethanol concentrations in the medium. This study aimed to improve the ethanol tolerance of an industrial Saccharomyces cerevisiae strain by modifying the promoter region of two genes: the TRP1 gene involved in the synthesis of tryptophan, or the MSN2 gene encoding for a transcription factor that regulates the general stress response in S. cerevisiae. The recombinant yeast strains were developed using PCR-based genomic engineering techniques, to insert the strong and constitutive PADH1 promoter in the promoter region of the target genes. Although the industrial strain used (CAT-1) is diploid, only one allele of the target gene was modified. After confirmation by PCR of the changes made in the genome of the recombinant strains, gene overexpression was quantified by qRT-PCR. Our results show that the industrial yeast strain is more tolerant to ethanol (being able to grow in up to 14% alcohol), when compared to a laboratory strain (10% ethanol completely inhibited growth of these cells). In both types of strain overexpressing the TRP1 gene clearly improved ethanol tolerance. The industrial strains overexpressing the MSN2 gene, or a truncated version of the gene (MSN2-T, without the first 48 amino acids), were also more ethanol tolerant. The strain that overexpresses the MSN2 gene was also more resistant to a salinity stress, but more sensitive to an oxidative stress, while the strain that overexpresses MSN2-T was more resistant to this last stress. The analysis of the intracellular levels of reactive oxygen species (ROS) revealed that stress promoted by ethanol significantly increases the levels of ROS in cells, and there was a reduction in the amount of these compounds in the strains modified in the MSN2 gene. Afterwards, it was investigated whether this improvement in the cellular growth under high ethanol concentrations leads to higher ethanol productivity during fermentation of high (200 g/L) sucrose concentrations, even in the presence of different stressful ethanol concentrations at the beginning of fermentation. The results revealed that there were no significant differences between the industrial strain CAT-1 and the recombinant strains in the different fermentation parameters analyzed, both in simple batch and fed batch processes with cell recycle. The alcoholic stress affected mainly the consumption of monosaccharides (glucose and fructose) produced by the hydrolysis of sucrose. In conclusion, the results suggest that increased tolerance toXIIethanol (through genomic modifications carried out in this work), does not necessarily mean a higher ethanol production by an industrial S. cerevisiae strain.Stambuk, Boris Juan Carlos UgarteUniversidade Federal de Santa CatarinaBücker, Augusto2015-02-05T20:38:32Z2015-02-05T20:38:32Z2014info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesis111 p.| il., grafs., tabs.application/pdf328840https://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/129051porreponame:Repositório Institucional da UFSCinstname:Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)instacron:UFSCinfo:eu-repo/semantics/openAccess2015-02-05T20:38:32Zoai:repositorio.ufsc.br:123456789/129051Repositório InstitucionalPUBhttp://150.162.242.35/oai/requestopendoar:23732015-02-05T20:38:32Repositório Institucional da UFSC - Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)false
dc.title.none.fl_str_mv Engenharia genômica de linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae visando melhorar a tolerância ao etanol
title Engenharia genômica de linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae visando melhorar a tolerância ao etanol
spellingShingle Engenharia genômica de linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae visando melhorar a tolerância ao etanol
Bücker, Augusto
Bioquímica
Saccharomyces cerevisiae
Alcool
title_short Engenharia genômica de linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae visando melhorar a tolerância ao etanol
title_full Engenharia genômica de linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae visando melhorar a tolerância ao etanol
title_fullStr Engenharia genômica de linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae visando melhorar a tolerância ao etanol
title_full_unstemmed Engenharia genômica de linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae visando melhorar a tolerância ao etanol
title_sort Engenharia genômica de linhagem industrial de Saccharomyces cerevisiae visando melhorar a tolerância ao etanol
author Bücker, Augusto
author_facet Bücker, Augusto
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Stambuk, Boris Juan Carlos Ugarte
Universidade Federal de Santa Catarina
dc.contributor.author.fl_str_mv Bücker, Augusto
dc.subject.por.fl_str_mv Bioquímica
Saccharomyces cerevisiae
Alcool
topic Bioquímica
Saccharomyces cerevisiae
Alcool
description Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2014.
publishDate 2014
dc.date.none.fl_str_mv 2014
2015-02-05T20:38:32Z
2015-02-05T20:38:32Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
format doctoralThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv 328840
https://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/129051
identifier_str_mv 328840
url https://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/129051
dc.language.iso.fl_str_mv por
language por
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv 111 p.| il., grafs., tabs.
application/pdf
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Repositório Institucional da UFSC
instname:Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)
instacron:UFSC
instname_str Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)
instacron_str UFSC
institution UFSC
reponame_str Repositório Institucional da UFSC
collection Repositório Institucional da UFSC
repository.name.fl_str_mv Repositório Institucional da UFSC - Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)
repository.mail.fl_str_mv
_version_ 1808652414233870336

Registros relacionados