Avaliação da expressão de receptores siglec-5 e -9 em neutrófilos humanos estimulados com LPS

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Amaral, Flávia Cardoso
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFSC
Texto Completo: https://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/205135
Resumo: Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2018.
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spelling Avaliação da expressão de receptores siglec-5 e -9 em neutrófilos humanos estimulados com LPSFarmacologiaSepseDissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2018.A superestimulação dos neutrófilos circulantes durante a sepse contribui para o dano tecidual e falência de múltiplos órgãos. Dessa forma, a elucidação de receptores que podem estar envolvidos com a regulação do estado de ativação dos neutrófilos vem sendo alvo de estudos. Os Siglecs (Sialic acid-binding immunoglobulin super-family lectins) são receptores expressos em várias células do sistema imunológico que possuem um domínio intracelular inibitório chamado de ITIM (Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs), que permite, através do recrutamento de fosfatases SHP-1 e 2, interferir em vias ativadas por outros receptores. Os Siglecs ligam-se ao ácido siálico presente na membrana plasmática da própria célula, mantendo o sítio de interação mascarado. A ativação celular ou a ação da enzima neuraminidase, que cliva o ácido siálico, liberam o sítio de ligação e permite a interação com o ácido siálico livre, presente em células adjacentes ou em patógenos. O objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão de receptores Siglec em neutrófilos humanos estimulados com LPS e identificar os mecanismos envolvidos em sua regulação. Nossos resultados mostraram que neutrófilos humanos (células CD66b+) têm alta expressão de Siglec-5 e -9, moderada expressão de Siglec-3 e -7 e não expressam Siglec-1, -2, -6, -8 ou -10. O tratamento do sangue total com LPS (1,0 µg/mL) por 3 horas aumentou significativamente a expressão de Siglec-5 e de Siglec-9 de maneira dose-dependente. Sendo que o pico de expressão desses receptores ocorreu entre 1,5 e 3 horas após o estímulo. Os neutrófilos possuem estoque intracelular de Siglec-5 e -9 que aparentemente são translocados para a membrana após a ativação com o LPS (1,0 µg/mL). Observamos ainda uma diminuição da expressão dos ligantes de Siglec-5 e -9 e de ácido siálico na conformação a-2,3 na membrana dos neutrófilos estimulados. Escherichia coli (107; 108 UFC) também induziu um aumento significativo na expressão de Siglec-5 em neutrófilos após 1,5 h de incubação, o que não foi observado com Enterococcus gallinarum (106; 107; 108 UFC) e o Pam3Cys (1,0 µg/mL). Para avaliar a atividade da neuraminidase e sua relação na expressão dos receptores, utilizamos o inibidor de neuraminidase, oseltamivir (Tamiflu). A incubação por 1,5 h do sangue total com o Tamiflu (250 µM) diminuiu a expressão de Siglec-5, mas promoveu alterações no tamanho e complexidade nos neutrófilos. Os estudos envolvendo pacientes sépticos não apresentaram diferenças quando comparado aos pacientes controles, exceto pelo tratamento com Tamiflu (10 µM) que modulou a expressão de Siglec-5, mas não de Siglec-9. Em conjunto, nossos resultados demonstram que o LPS aumenta a expressão de Siglec-5 e -9 em neutrófilos e esse mecanismo pode ser dependente da ação da neuraminidase.Abstract : Over-stimulation of circulating neutrophils during sepsis contributes to tissue damage and multiple organ failure. Thus, identify and understand receptors that may be involved in the regulation of the neutrophil activation state have been subject of this study. Siglecs (Sialic acid-binding immunoglobulin super-family lectins) are immune system cells receptor that have an inhibitory intracellular domain called ITIM (Immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motifs), which, through the recruitment of SHP- 1 and 2, suppress/inhibit other receptors pathway activation. Siglecs binds to sialic acid present on cells plasma membrane, keeping the site of interaction masked. Cell activation or the action of the enzyme neuraminidase, which cleaves sialic acid, releases the binding site and allows interaction with free sialic acid and sialic acid in adjacent cells or pathogens. The aim of the present study was to evaluate the expression of Siglec receptors on human neutrophils stimulated with LPS and to identify the mechanisms involved in their regulation. Our results showed that human neutrophils (CD66b+ cells) have high expression of Siglec-5 and -9, moderate expression of Siglec-3 and -7 and do not express Siglec-1, -2, -6, -8 or -10. The treatment of whole blood with LPS (1.0 µg/ml) for 3 hours significantly increased the expression of Siglec-5 and Siglec-9 in a dose-dependent manner. The highest expression of these receptors occurred between 1.5 and 3 hours after the stimulus. Neutrophils have intracellular reservoir of Siglec-5 and -9 that are apparently translocated to the membrane after activation with LPS (1.0 µg/mL). It was also observed that the expression of Siglec-5 and -9 ligands and sialic acid (a-2,3 conformation) on the neutrophil cell membrane decrease after stimulation. Escherichia coli (107; 108 CFU) also induced a significant increase in Siglec-5 expression in neutrophils after 1.5 h of incubation, which was not observed with Enterococcus gallinarum (106; 107; 108 CFU) and Pam3Cys (1,0 µg/mL). To evaluate the activity of neuraminidase and its relationship in receptor expression, we used the neuraminidase inhibitor, oseltamivir (Tamiflu). The incubation for 1.5 h of whole blood with Tamiflu (250 µM) decreased Siglec-5 expression, and induced changes in neutrophils size and complexity. Studies involving septic patients showed no difference in Siglecs expressions when compared to control patients, except for the treatment with Tamiflu (10 µM) that modulated the expression of Siglec-5, but not Siglec-9. Taken together, our results demonstrate that LPS increases the expression of Siglec-5 and -9 in neutrophils and this mechanism may be dependent on the neuraminidase activation or sialic acid cleavage by neuraminidase.Spiller, FernandoUniversidade Federal de Santa CatarinaAmaral, Flávia Cardoso2020-03-31T13:28:31Z2020-03-31T13:28:31Z2018info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesis117 p.| il., gráfs.application/pdf358641https://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/205135porreponame:Repositório Institucional da UFSCinstname:Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)instacron:UFSCinfo:eu-repo/semantics/openAccess2020-03-31T13:28:31Zoai:repositorio.ufsc.br:123456789/205135Repositório InstitucionalPUBhttp://150.162.242.35/oai/requestopendoar:23732020-03-31T13:28:31Repositório Institucional da UFSC - Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)false
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