Utilização da microscopia confocal para determinação de superóxido mediante estímulo com luteolina em células endoteliais

• Autor(a) principal: Cruz, Yan Milen Coelho [UNIFESP]
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Trabalho de conclusão de curso
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNIFESP
• Texto Completo: https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/67443
• topic: Endotélio; Superóxido; Luteolina; Dihidroetídio; Microscopia confocal; Endothelium; Luteolin; Superoxide; Dihidroethidium; Microscopy

Introdução: O estresse oxidativo endotelial afeta todo o sistema circulatório, sendo marcado por diversos agentes reativos denominados espécies reativas de oxigênio. A luteolina é um flavonóide com efeito antioxidante, mas seus efeitos sobre as células endoteliais são pouco conhecidos. O presente trabalho utilizou a sonda dihidroetidina (DHE) em microscopia confocal para investigar a geração de superóxido (O2•-) em células endoteliais de ratos. Foram analisados os efeitos de luteolina isolada ou em associação à Angiotensina II (Ang II), um peptídeo hipertensor relacionado ao estresse oxidativo vascular. Métodos: Células endoteliais cultivadas da veia cava de rato foram previamente plaqueadas em lamínulas, pré-tratadas com a sonda fluorescente DHE [10 μM] por 30 minutos e expostas à luteolina [10, 20 e 50 μM] por 10 minutos, em presença ou ausência de Ang II [1μM]. Controles positivo e negativo foram feitos pelo tratamento das células com meio de cultura contendo alto nível de glicose (HG, 25 mM) ou tempol (300 μM), respectivamente. As células foram fixadas e as lamínulas foram analisadas em um microscópio confocal. Os comprimentos de onda utilizados foram 490 nm excitação e 590 nm emissão, e as configurações do sistema de aquisição de imagem se mantiveram padronizadas para todas as capturas. A intensidade da fluorescência foi quantificada célula a célula por densitometria, empregando-se ferramentas do software ImageJ para delimitação automática do contorno celular individualmente. Resultados: As imagens obtidas no microscópio confocal apresentaram alto grau de qualidade e foram analisadas com sucesso. A identificação do estresse oxidativo através da sonda DHE foi comprovada nas células incubadas com meio HG. Houve redução significativa da geração de O2•- após os tratamentos com luteolina 10 μM, 20 μM e 50 μM isolada e em associação com Ang II 1 μM em comparação às células não tratadas. (* P < .05) Conclusão: O ensaio de microscopia confocal mostrou que a luteolina reduz a geração de O2•- pelas células endoteliais em relação ao basal e na presença de Ang II. Esses resultados sugerem que o efeito antioxidante da luteolina no endotélio deve ser mais profundamente avaliado para melhor compreensão dos mecanismos de interação com Ang II. Esses dados também mostram consistência na metodologia empregada para utilização da sonda DHE como ferramenta para quantificação relativa de O2•- em culturas celulares.