Pesquisa de polimorfismos nas proteínas EspB e EspD e seu efeito na aderência de escherichia coli enteropatogênica atípica a células HeLa

• Autor(a) principal: Santos, Fernanda Fernandes dos [UNIFESP]
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNIFESP
• Texto Completo: https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=6717078; https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/52975
• topic: Aepec; EspB; EspD; Polymorphism; Type III secretion system; Translocon; Polimorfismos; Sistema de secreção do tipo III (Sst); Adhesion

As cepas de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) são subdivididas em EPEC típicas (tEPEC) e EPEC atípicas (aEPEC). Elas diferem, principalmente, em relação à produção da fímbria bundleforming pilus (BFP), que ocorre apenas em tEPEC. A proteína intimina é a principal adesina envolvida na aderência íntima de EPEC a células epiteliais, porém, enquanto BFP participa dos estágios iniciais de interação de tEPEC com essas células, pouco se sabe sobre as estruturas de aEPEC envolvidas no início do processo de colonização. Este estudo pretende investigar o papel do translocon do sistema de secreção do tipo III (SST3) como uma estrutura de aderência envolvida nos estágios iniciais do contato de aEPEC com células epiteliais e avaliar se polimorfismos em EspB e EspD, proteínas que compõem o translocon, bem como a expressão mais elevada dos genes correspondentes, além da presença de outras adesinas, poderiam resultar em diferenças na eficiência dessa aderência. Foram construídos mutantes em intimina a partir de sete cepas de aEPEC, utilizandose o vetor suicida pJP5603. Esses mutantes foram testados em células HeLa quanto a possíveis modificações na sua eficiência de aderência. Cinco desses mutantes perderam a capacidade aderente, enquanto dois permaneceram aderentes (20121 wt e 38813 wt) (p> 0,05). Esses últimos foram utilizados para gerar duplos mutantes eae/escN (genes que codificam intimina e a ATPase do SST3, respectivamente). A cepa 20121 wt, cujo duplo mutante em eae/escN perdeu sua capacidade aderente, foi também utilizada para gerar o mutante simples em espD e o duplo mutante eae/espD, empregandose o sistema de recombinação Lambda Red. Ambos os mutantes perderam a capacidade aderente, sugerindo que EspD contribui para a aderência dessa cepa. Em seguida, as sequências dos genes espB e espD das sete cepas de aEPEC foram obtidas e traduzidas em sequências de aminoácidos, as quais foram, então, comparadas entre si e com as sequências correspondentes às da cepa protótipo tEPEC E2348/69, utilizandose o software Clustal Omega. As análises preliminares dos domínios transmembrana de EspB e EspD e do domínio coiled coil da região carboxiterminal de EspD, que são importantes para ancoragem dessas proteínas à membrana de células epiteliais, mostraram que existem diferentes aminoácidos entre 20121 wt e as outras cepas de aEPEC, bem como em relação à cepa E2348/69. Interessantemente, o aminoácido 352 do domínio coiled coil da cepa 20121 wt difere, inclusive, quanto a sua carga, em relação aos aminoácidos encontrados nessa mesma posição nas outras cepas. Comparandose a expressão relativa de espB e espD por qRTPCR, demonstrouse que a cepa 20121 wt expressa 18 vezes mais esses genes do que a cepa aEPEC BA4095, cujo mutante em intimina perde a capacidade de aderência. Além disso, a pesquisa de adesinas potenciais, realizada com o software SPAAN, revelou que, o genoma da cepa 20121 wt codifica uma proteína homóloga a YadA que poderia contribuir para aumentar a eficiência da aderência dessa cepa por meio do translocon do SST3. Nossos achados sugerem que o translocon do SST3 pode desempenhar um papel adicional importante, como adesina, no início do processo de colonização. Além disso, a alta expressão de espB e espD, polimorfismos específicos nesses genes e/ou a presença de outras adesinas que atuem juntamente com o SST3 podem tornar cepas de aEPEC colonizadores intestinais mais eficientes.