Expressão e função dos receptores ativados por proteases em células odontoblastóides MDPC­-23

• Autor(a) principal: Alvarez, Marcela Maciel Palacio [UNIFESP]
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNIFESP
• Texto Completo: https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=4921233; http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/50523
• topic: Receptor Ativado Por Protease (Par); Células Mdpc-2; Inflamação Dentária; Complexo Pulpo-Dentinário

INTRODUÇÃO. Receptores Ativados por proteases (PARs) são receptores acoplados à proteína G, e, por serem ativados por clivagem proteolítica na sua região aminoterminal, atuam como sensores extracelulares de proteases. A ativação dos PARs desempenha um papel importante na regulação do desenvolvimento, inflamação, imunidade e angiogênese. A ativação dos PARs por sua via canônica induz a sinalização mediada por proteína G e dependente de β-arrestina. O objetivo do estudo foi investigar a expressão e papel dos PARs em células odontobláticas de rato MDPC- 23. MATERIAIS E MÉTODOS. A regulação da expressão de PARs nas células MDPC-23 foi investigada por reação em cadeia de polimerase em tempo real (RTPCR), na ausência ou na presença de LPS (0,1 μg/ml). As células MDPC-23 também foram estimuladas com tripsina 10-6 M e com peptídeo ativador de PAR-2 SLIGRLNH2 10-4M para avaliar alterações na expressão gênica de citocinas inflamatórias e em metaloproteases de matriz (MMPs). Os anticorpos contra o PAR-1 e PAR-2 foram utilizados para analisar a expressão proteica desses receptores por citometria de fluxo e microscopia confocal; Ensaios de imunofluorescência de dente humano cariado e não-cariado foram realizados para avaliar a presença de PAR-2. As curvas de resposta à concentração de Ca2+ foram obtidas na presença de diferentes agonistas específicos, tais como, trombina para ativação de PAR-1 ou tripsina para PAR-2 e o peptídeo ativador de PAR-2 de rato (SLIGRL-NH2). Medições citoplasmáticas do influxo de Ca2+ na presença de diferentes agonistas de PARs foram monitoradas pelas mudanças na intensidade de fluorescência da sonda Fluo-4 em tempo real usando o sistema de leitor de microplacas FlexStation Station 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO. Reações de RT-PCR e imunofluorescência, demonstraram a expressão de PAR-1 e PAR-2 em células MDPC-23. Estudos imuno-histoquímicos por microscopia confocal de dente humano mostraram intensa coloração positiva para a presença de PAR-2 em tecido cariado comparado com o controle. Nossos resultados mostram que a LPS promoveu uma elevação na expressão gênica de PAR-1 e PAR- 2, bem como, uma elevação na expressão gênica de IL-6 e TNF-α nas células MDPC- 23. Tratamento das células MDPC-23 com tripsina ou com o peptídeo ativador de PAR-2 SLIGRL-NH2, causou um aumento de Ca2+ citoplasmático dose e tempodependente. Porém, quando o receptor PAR-2 foi estimulado por seus agonistas, foi xix observado um aumento na expressão gênica de TLR4, bem como, uma diminuição na expressão gênica de IL-6, NF-κB e TNF-α. Também observamos alteração na expressão gênica de MMPs mediada por estímulo de PAR-2. A estimulação de PAR- 2 ocasionou aumento na expressão gênica de MMP1, MMP9 e MMP14. Por outro lado, a estimulação de PAR-2 promoveu diminuições na expressão de MMP2 e MMP13. CONCLUSÃO. Os resultados apresentados demonstram, pela primeira vez, que as células MDPC-23 constitutivamente expressam os receptores PAR-1 e PAR- 2, bem como indicam que esses receptores estão envolvidos na resposta inflamatória e no processo de dentinogênese.