O papel dos glicosaminoglicanos no controle do estresse nitrosativo do retículo endoplasmático
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2021 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da UNIFESP |
Texto Completo: | https://repositorio.unifesp.br/xmlui/handle/11600/62451 |
Resumo: | Introdução. Nosso grupo tem investigado o papel dos glicosaminoglicanos (GAGs) na regulação da atividade da enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS). Verificamos que naturalmente os GAGs controlam a ativação da eNOS, no sítio regulatório positivo Ser1177, por inibir a sinalização celular mediada pelo eixo integrina/FAK/PI3K/AKT/eNOS, bem como, por favorecer a ativação da PKCα na caveolae, que leva a fosforilação da eNOS no sítio regulatório negativo Thr495, resultando em maior inibição da produção de NO nas células CHO-K1 selvagens. Nas células mutantes CHO-745, defectivas na biossíntese de GAGs, a ausência de glicosaminoglicanos na superfície celular dessas células mutantes leva uma ativação permanente da eNOS, por aumento da fosforilação no sítio regulatório positivo Ser1177, bem como, uma grande diminuição da fosforilação no sítio regulatório negativo Trh495. O NO é um segundo mensageiro que controla a expressão de vários genes relacionados ao metabolismo das espécies nitrosativas/oxidativas, a biogênese mitocondrial e ao metabolismo de cálcio. Dados da literatura mostram que o NO ocasiona o estresse nitrosativo do retículo endoplasmático (RE). Variações no nível citosólico de cálcio, a inibição da glicosilação de proteínas N-ligadas, o estresse nitrosativo/oxidativo, entre outros fatores, podem levar ao estresse do RE, o qual dispara vias de sinalização específicas incluindo a Unfolded Protein Response (UPR). A UPR promove aumento na expressão de chaperonas, inibição da tradução de novas proteínas e aumento da degradação de proteínas mal-enoveladas e apoptose. Objetivo. Investigar a indução do estresse do RE nas células CHO-K1 selvagens e no seu mutante CHO-745. Métodos. Estudos de mobilização de Ca2+ por ação do agonista UDP do receptor P2Y6, bem como, pelo bloqueio da enzima Ca2+-ATPase do RE pela ação da tapsigargina. Estudos do transiente citoplasmático de Ca2+ por microfluorimetria, na presença de doadores de NO (GSNO) ou na presença de bloqueadores da síntese de NO (L-NAME). Análise da expressão do receptor P2Y6 por citometria de fluxo, análise da expressão gênica da proteína NCX1 por RT-PCR e por western-blotting. Análise do tráfego intracelular da enzima catepsina B, residente da rota secretória (RE/ Golgi/ Lisossomos), por microscopia confocal de fluorescência xv nas células CHO. Estudo da viabilidade celular pelo teste de MTT das linhagens CHO, na ausência ou na presença de substâncias indutoras do estresse do RE, como a tapsigargina e a tunicamicina. Análise da expressão gênica das proteínas sinalizadoras da via do estresse do RE: PERK, IRE1α e CHOP por Western blotting nas células CHO, na presença ou na ausência de doador de NO. Resultados. As células CHO-745 mobilizam cerca de 40% menos de Ca2+ do RE para o citosol do que as células CHO-K1. Na presença do inibidor da síntese de NO, L-NAME, a resposta da fluorescência para a mobilização de cálcio do RE induzida pelo UDP é máxima (Emax= 417 ± 24 RFU), enquanto na presença de indutores da síntese de NO, a resposta a mobilização de cálcio do RE induzida pelo UDP é mínima (Emax= 162 ± 10 RFU). A célula mutante CHO-745 expressa cerca de 2,6 vezes mais a isoforma da proteína NCX1 do que as células selvagens CHO-K1. A análise das imagens obtidas por microscopia confocal mostrou que a calreticulina, chaperona e proteína tampão de Ca2+ do RE, nas células CHO-745 é cerca de 2,5 vezes mais expressa do que nas células CHO-K1. A enzima catepsina B está menos presente no RE das células CHO-K1 (37 ± 3%) do que nas células CHO-745 (85 ± 6 %), sugerindo que essa enzima lisossomal está acumulada no RE das células CHO-745. As células CHO-745 são cerca de 2 vezes mais resistentes a morte celular disparada por tapsigargina ou pela tunicamicina do que as células CHO-K1. Verificamos que a enzima PERK está cerca de 1,7 vezes mais expressa e 3 vezes mais fosforilada nas células CHO-745 do que nas células CHO-K1, sua expressão é ativada por NO. A proteína IRE1α está 2 vezes mais processada proteolíticamente nas células CHO-745, sua expressão e processamento proteolítico são controlados por NO. Por fim, a proteína CHOP está cerca de 1,6 vezes mais expressa nas células CHO-745 do que nas células CHO-K1. Conclusão. Para sobreviver ao maior nível de estresse nitrosativo, as células CHO-745 tiveram que se adaptar. Nossos resultados mostram que a diminuição da concentração citosólica de cálcio, a elevação da expressão gênica de PERK, de sua maior fosforilação, bem como, a diminuição da quantidade efetiva de IRE1α pelo aumento de sua proteólise fazem parte deste mecanismo adaptativo ao estresse de retículo endoplasmático induzido pelo NO. |
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Nas células mutantes CHO-745, defectivas na biossíntese de GAGs, a ausência de glicosaminoglicanos na superfície celular dessas células mutantes leva uma ativação permanente da eNOS, por aumento da fosforilação no sítio regulatório positivo Ser1177, bem como, uma grande diminuição da fosforilação no sítio regulatório negativo Trh495. O NO é um segundo mensageiro que controla a expressão de vários genes relacionados ao metabolismo das espécies nitrosativas/oxidativas, a biogênese mitocondrial e ao metabolismo de cálcio. Dados da literatura mostram que o NO ocasiona o estresse nitrosativo do retículo endoplasmático (RE). Variações no nível citosólico de cálcio, a inibição da glicosilação de proteínas N-ligadas, o estresse nitrosativo/oxidativo, entre outros fatores, podem levar ao estresse do RE, o qual dispara vias de sinalização específicas incluindo a Unfolded Protein Response (UPR). A UPR promove aumento na expressão de chaperonas, inibição da tradução de novas proteínas e aumento da degradação de proteínas mal-enoveladas e apoptose. Objetivo. Investigar a indução do estresse do RE nas células CHO-K1 selvagens e no seu mutante CHO-745. Métodos. Estudos de mobilização de Ca2+ por ação do agonista UDP do receptor P2Y6, bem como, pelo bloqueio da enzima Ca2+-ATPase do RE pela ação da tapsigargina. Estudos do transiente citoplasmático de Ca2+ por microfluorimetria, na presença de doadores de NO (GSNO) ou na presença de bloqueadores da síntese de NO (L-NAME). Análise da expressão do receptor P2Y6 por citometria de fluxo, análise da expressão gênica da proteína NCX1 por RT-PCR e por western-blotting. Análise do tráfego intracelular da enzima catepsina B, residente da rota secretória (RE/ Golgi/ Lisossomos), por microscopia confocal de fluorescência xv nas células CHO. Estudo da viabilidade celular pelo teste de MTT das linhagens CHO, na ausência ou na presença de substâncias indutoras do estresse do RE, como a tapsigargina e a tunicamicina. Análise da expressão gênica das proteínas sinalizadoras da via do estresse do RE: PERK, IRE1α e CHOP por Western blotting nas células CHO, na presença ou na ausência de doador de NO. Resultados. As células CHO-745 mobilizam cerca de 40% menos de Ca2+ do RE para o citosol do que as células CHO-K1. Na presença do inibidor da síntese de NO, L-NAME, a resposta da fluorescência para a mobilização de cálcio do RE induzida pelo UDP é máxima (Emax= 417 ± 24 RFU), enquanto na presença de indutores da síntese de NO, a resposta a mobilização de cálcio do RE induzida pelo UDP é mínima (Emax= 162 ± 10 RFU). A célula mutante CHO-745 expressa cerca de 2,6 vezes mais a isoforma da proteína NCX1 do que as células selvagens CHO-K1. A análise das imagens obtidas por microscopia confocal mostrou que a calreticulina, chaperona e proteína tampão de Ca2+ do RE, nas células CHO-745 é cerca de 2,5 vezes mais expressa do que nas células CHO-K1. A enzima catepsina B está menos presente no RE das células CHO-K1 (37 ± 3%) do que nas células CHO-745 (85 ± 6 %), sugerindo que essa enzima lisossomal está acumulada no RE das células CHO-745. As células CHO-745 são cerca de 2 vezes mais resistentes a morte celular disparada por tapsigargina ou pela tunicamicina do que as células CHO-K1. Verificamos que a enzima PERK está cerca de 1,7 vezes mais expressa e 3 vezes mais fosforilada nas células CHO-745 do que nas células CHO-K1, sua expressão é ativada por NO. A proteína IRE1α está 2 vezes mais processada proteolíticamente nas células CHO-745, sua expressão e processamento proteolítico são controlados por NO. Por fim, a proteína CHOP está cerca de 1,6 vezes mais expressa nas células CHO-745 do que nas células CHO-K1. Conclusão. Para sobreviver ao maior nível de estresse nitrosativo, as células CHO-745 tiveram que se adaptar. Nossos resultados mostram que a diminuição da concentração citosólica de cálcio, a elevação da expressão gênica de PERK, de sua maior fosforilação, bem como, a diminuição da quantidade efetiva de IRE1α pelo aumento de sua proteólise fazem parte deste mecanismo adaptativo ao estresse de retículo endoplasmático induzido pelo NO.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)68 f.porUniversidade Federal de São PauloGlicosaminoglicanosEstresse do retículo endoplasmáticoÓxido nítricoSinalização por cálcioMorte celularO papel dos glicosaminoglicanos no controle do estresse nitrosativo do retículo endoplasmáticoinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UNIFESPinstname:Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)instacron:UNIFESPEscola Paulista de Medicina (EPM)Ciências Biológicas (Biologia Molecular)ORIGINALDISSERTAÇÃO-VERSÃO FINAL.pdfDISSERTAÇÃO-VERSÃO 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Introdução. Nosso grupo tem investigado o papel dos glicosaminoglicanos (GAGs) na regulação da atividade da enzima óxido nítrico sintase endotelial (eNOS). Verificamos que naturalmente os GAGs controlam a ativação da eNOS, no sítio regulatório positivo Ser1177, por inibir a sinalização celular mediada pelo eixo integrina/FAK/PI3K/AKT/eNOS, bem como, por favorecer a ativação da PKCα na caveolae, que leva a fosforilação da eNOS no sítio regulatório negativo Thr495, resultando em maior inibição da produção de NO nas células CHO-K1 selvagens. Nas células mutantes CHO-745, defectivas na biossíntese de GAGs, a ausência de glicosaminoglicanos na superfície celular dessas células mutantes leva uma ativação permanente da eNOS, por aumento da fosforilação no sítio regulatório positivo Ser1177, bem como, uma grande diminuição da fosforilação no sítio regulatório negativo Trh495. O NO é um segundo mensageiro que controla a expressão de vários genes relacionados ao metabolismo das espécies nitrosativas/oxidativas, a biogênese mitocondrial e ao metabolismo de cálcio. Dados da literatura mostram que o NO ocasiona o estresse nitrosativo do retículo endoplasmático (RE). Variações no nível citosólico de cálcio, a inibição da glicosilação de proteínas N-ligadas, o estresse nitrosativo/oxidativo, entre outros fatores, podem levar ao estresse do RE, o qual dispara vias de sinalização específicas incluindo a Unfolded Protein Response (UPR). A UPR promove aumento na expressão de chaperonas, inibição da tradução de novas proteínas e aumento da degradação de proteínas mal-enoveladas e apoptose. Objetivo. Investigar a indução do estresse do RE nas células CHO-K1 selvagens e no seu mutante CHO-745. Métodos. Estudos de mobilização de Ca2+ por ação do agonista UDP do receptor P2Y6, bem como, pelo bloqueio da enzima Ca2+-ATPase do RE pela ação da tapsigargina. Estudos do transiente citoplasmático de Ca2+ por microfluorimetria, na presença de doadores de NO (GSNO) ou na presença de bloqueadores da síntese de NO (L-NAME). Análise da expressão do receptor P2Y6 por citometria de fluxo, análise da expressão gênica da proteína NCX1 por RT-PCR e por western-blotting. Análise do tráfego intracelular da enzima catepsina B, residente da rota secretória (RE/ Golgi/ Lisossomos), por microscopia confocal de fluorescência xv nas células CHO. Estudo da viabilidade celular pelo teste de MTT das linhagens CHO, na ausência ou na presença de substâncias indutoras do estresse do RE, como a tapsigargina e a tunicamicina. Análise da expressão gênica das proteínas sinalizadoras da via do estresse do RE: PERK, IRE1α e CHOP por Western blotting nas células CHO, na presença ou na ausência de doador de NO. Resultados. As células CHO-745 mobilizam cerca de 40% menos de Ca2+ do RE para o citosol do que as células CHO-K1. Na presença do inibidor da síntese de NO, L-NAME, a resposta da fluorescência para a mobilização de cálcio do RE induzida pelo UDP é máxima (Emax= 417 ± 24 RFU), enquanto na presença de indutores da síntese de NO, a resposta a mobilização de cálcio do RE induzida pelo UDP é mínima (Emax= 162 ± 10 RFU). A célula mutante CHO-745 expressa cerca de 2,6 vezes mais a isoforma da proteína NCX1 do que as células selvagens CHO-K1. A análise das imagens obtidas por microscopia confocal mostrou que a calreticulina, chaperona e proteína tampão de Ca2+ do RE, nas células CHO-745 é cerca de 2,5 vezes mais expressa do que nas células CHO-K1. A enzima catepsina B está menos presente no RE das células CHO-K1 (37 ± 3%) do que nas células CHO-745 (85 ± 6 %), sugerindo que essa enzima lisossomal está acumulada no RE das células CHO-745. As células CHO-745 são cerca de 2 vezes mais resistentes a morte celular disparada por tapsigargina ou pela tunicamicina do que as células CHO-K1. Verificamos que a enzima PERK está cerca de 1,7 vezes mais expressa e 3 vezes mais fosforilada nas células CHO-745 do que nas células CHO-K1, sua expressão é ativada por NO. A proteína IRE1α está 2 vezes mais processada proteolíticamente nas células CHO-745, sua expressão e processamento proteolítico são controlados por NO. Por fim, a proteína CHOP está cerca de 1,6 vezes mais expressa nas células CHO-745 do que nas células CHO-K1. Conclusão. Para sobreviver ao maior nível de estresse nitrosativo, as células CHO-745 tiveram que se adaptar. Nossos resultados mostram que a diminuição da concentração citosólica de cálcio, a elevação da expressão gênica de PERK, de sua maior fosforilação, bem como, a diminuição da quantidade efetiva de IRE1α pelo aumento de sua proteólise fazem parte deste mecanismo adaptativo ao estresse de retículo endoplasmático induzido pelo NO. |
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