Relação estrutura-atividade entre os receptores AT1 e AT2 da angiotensina II à luz da estrutura do receptor CXCR4 da quimiocina

• Autor(a) principal: Martin, Renan Paulo [UNIFESP]
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNIFESP
• Texto Completo: http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/23230
• topic: Receptor tipo 1 de angiotensina; Receptor tipo 2 de angiotensina; Mutagênese; Angiotensina II; AT1 receptor; AT2 receptor; angiotensin II; structure-activity relationship; mutagenesis; binding

A angiotensina II (AngII) e um potente agente do sistema renina-angiotensina participando da regulacao da pressao arterial e na homeostase hidromineral. Seu efeitos fisiologicos sao mediados pelos receptores tipo 1 (AT1) e tipo 2 (AT2) que possuem respostas contrarias nas suas vias de sinalizacao. Alguns modelos de interacao agonista-receptor vem sendo propostos onde e possivel destacar alguns residuos importantes para interacao do agonista ao receptor como Asp1, Arg2 e Tyr4 alem das extremidades N e C-terminais. Numa etapa inicial foi proposta para avaliar a possiblidade da substituicao do metodo de estudo de ligacao tradicional baseado em uso de radioligantes por um nao radioativo (fluoroforo). Foi entao utilizado o lantanideo Europio (Eu3+) como marcador do ligante nos ensaios de competicao pelo sitio de ligacao comparando ao uso do 3H. Depois disso, o projeto foi dividido em duas etapas, sendo a primeira, uma abordagem pratica, onde diferentes ligantes foram testados e as afinidades de ligacao de cada um comparada com aquelas dos receptores AT1 e AT2. Posteriormente foram obtidas 3 mutacoes sitio dirigidas no receptor AT2 onde a primeira causou o rompimento da segunda ponte SS (C35S), a segunda a substituicao das Asn127 por Gly no meio da helice III (N127G) e a terceira a substituicao da Asp297 por Ala (D297A). Alem disso foi proposto um metodo teorico de estudo usando modelagem molecular dos receptores AT1 e AT2 por homologia ao CXCR4. Os testes de ligacao usando os dois metodos propostos mostraram resultados equivalentes, razao pela qual se adotou o metodo fluorimetrico para o prosseguimento dos experimentos. E interessante destacar que a substituicao da Tyr4 por Ile provocou uma queda de afinidade de cerca de 100 vezes enquanto o uso da Phe na mesma posicao quase nao afetou a afinidade do ligante ao receptor AT1. Por outro lado o mesmo experimento conduzido com o receptor AT2 mostrou nao haver diferenca significativa. Esses resultados estao de acordo com os da literatura, uma vez que o residuo Asn111 do AT1 parece funcionar como botao que controla as mudancas do estado nao ativado para um estado propicio a ativacao que e um estado essencial para a correta acomodacao do ligante no receptor. Entretanto o receptor AT2 parece ja estar nesse estado independentemente da presenca desse residuo. Alem disso, o receptor AT2 possui um sitio de interacao mais flexivel do que o do AT1 que parece ser mais critico as mudancas no ligante. Na analise mutacional abordada, tanto o mutante C35S quanto o N127G nao apresentaram mudancas significativas no perfil de resposta aos ligantes estudados. Por outro lado o receptor AT2 carregando a mutacao D297A sofreu uma queda drastica na capacidade de ligacao com todos os analogos testados, indicando assim que esse residuo e crucial para a interacao com o segmento N-terminal da AngII. Os resultados de dinamica corroboram com os dados experimentais reforcando a melhor acomodacao da molecula de AngII ao receptor AT2 quando comparada ao receptor AT1