Estudo molecular e funcional de genes identificados por sequenciamento paralelo em larga escala numa coorte de pacientes com hipotiroidismo congênito por disgenesias tiroidianas

• Autor(a) principal: Kizys, Marina Malta Letro [UNIFESP]
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNIFESP
• Texto Completo: https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=3855116; https://repositorio.unifesp.br/handle/11600/46655
• topic: Disgenesia da tireoide; Hipotireoidismo congênito; Exoma; Sequenciamento de nucleotídeos em larga escala; Disgenesia of thyroid; Congenital hypothyroidism; Exoma; Sequencing of nucleotides in large scale

O hipotiroidismo congênito (HC) é uma das doenças endócrinas mais comuns entre recém-nascidos, com incidência de 1:1500-4000. O HC é causado, principalmente, por malformações embriológicas da tiroide, conhecidas como disgenesias tiroidianas (DTs). Acredita-se que as DTs são originadas a partir de alterações de especificação, proliferação e sobrevivência das células precursoras tiroidianas. Sabe-se que a embriogênese tiroidiana é controlada por diversos fatores de transcrição, entre esses NKX2-1, FOXE1, PAX8 e HHEX. Entretanto, apenas uma minoria dos pacientes com HC apresenta mutações nestes fatores de transcrição. Novos genes derivados de modelos animais relacionados ao desenvolvimento da tiroide tem sido descritos. Assim, ampliamos o estudo destes genes em pacientes diagnosticados com DTs. Nesta primeira etapa, realizamos o rastreamento de mutações por meio de sequenciamento genético pelo método de Sanger. Numa segunda etapa, em busca de eventuais novos genes candidatos de HC, investimos no estudo molecular por whole exome sequencing (WES). Neste sentido, desenvolvemos um algoritmo de decisões de bioinformática para a análise, tanto particularizada, quanto global de genes. Por meio deste algoritmo identificamos genes possivelmente relacionados ao fenótipo de diversas formas de DTs. Rastreamos dois genes candidatos inicialmente apontados pelo WES: oxidase dual 2 (DUOX2) e coiled-coil domain-containing protein 114 (CCDC114) em número adicional de pacientes. Além disso, seus respectivos mutantes foram estudados funcionalmente in vitro e in vivo (zebrafish). Usando WES e Sanger, identificamos variações no gene CCDC114 em pai e seu filho, assim como em 5 de 6 pacientes esporádicos com hemiagenesia. Análises funcionais in silico sugeriram que 3 das 6 variações eram deletérias em pelo menos dois programas de predição diferentes. Em análises funcionais in vivo, realizamos experimentos com doses crescentes de morfolino em embriões de zebrafish que mostraram um fenótipo de posicionamento tiroidiano e cardíaco alterados de forma aleatória, não sendo possível correlacionar as variantes deletérias de CCDC114 humano com a perda de função de seu ortólogo em zebrafish. Assim, apesar da ausência de fenótipo tiroidiano específico em zebrafish, observamos a associação de mutações no CCDC114 com a hemiagenesia em humanos. Usando a mesma abordagem, identificamos 15 variações no gene DUOX2 em pacientes com ectopia, sendo 7 novas: p.Gly201Glu, p.Leu264CysfsX57, p.Pro609Ser, p.Met650Thr, p.Glu810Ter, p.Met822Val e p.Glu1017Gly. Todas as crianças com mutações no DUOX2 segregaram com HC, o que foi confirmado pelos valores elevados de hormônio tiroestimulante, seja por ocasião da triagem neonatal, seja no diagnóstico confirmatório pós-natal. A cintilografia tiroidiana confirmou ectopia em todos os afetados. Estas mutações estão em heterozigose composta com variantes polimórficas funcionais previamente relacionadas com hipotiroidismo transitório ou permanente. Verificamos, in vitro, que 3 destas 7 mutações impedem a translocação do complexo DUOX2/DUOXA2 para a membrana e impactam sobre a atividade de DUOX2 e tiroperoxidase necessária para a síntese de hormônios tiroidianos. Nossos dados reforçam a utilidade da abordagem de WES para casos com etiopatogenia complexa. Parte dos genes apontados por WES foram achados inesperados, tendo-se como base a função primária desses genes já reportados na literatura, como no caso do DUOX2, em que, além do conhecido papel na hormonogênese, parece participar da ontogênese tiroidiana.