Supressor tumoral ABI3 (ABI family member 3): desvendando os mecanismos moleculares nos tumores da tiroide humana

• Autor(a) principal: Moraes, Lais de Sousa [UNIFESP]
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UNIFESP
• Texto Completo: https://sucupira.capes.gov.br/sucupira/public/consultas/coleta/trabalhoConclusao/viewTrabalhoConclusao.jsf?popup=true&id_trabalho=4017158; http://repositorio.unifesp.br/handle/11600/47364
• topic: Neoplasias da glândula tireoide; Genes abi; Metilação de DNA; Proteômica; Família de proteínas da síndrome de wiskott-aldrich; Proteína oncogênica akt; Neoplasms of the thyroid gland; Abi genes; Methylation of dna; Proteomics; Protein family of wiskott-aldrich syndrome; Oncogenic protein akt

Nosso grupo identificou a perda de expressão do gene ABI3 nos carcinomas da tiroide. A análise funcional demonstrou que o reestabelecimento da expressão de ABI3 resulta na inibição das taxas de proliferação celular, invasão, migração e crescimento tumoral in vivo, associado ao aumento das taxas de senescência celular, sugerindo que ABI3 atue como um gene supressor de tumor. Porém ainda não há mecanismos genéticos/epigenéticos descritos que expliquem a mudança do perfil de expressão, assim como, ainda é pouco conhecida a via de sinalização pela qual ABI3 exerce sua função. Com base nos dados acerca da expressão de ABI3 nos tumores da tiroide, nosso primeiro objetivo foi investigar se a metilação no DNA poderia ser o mecanismo responsável pela perda de expressão de ABI3 nos carcinomas foliculares da tiroide (CFT). As linhagens celulares derivadas de carcinoma folicular da tiroide (WRO, FTC 238, FTC236 e FTC133) e de melanoma (NPA) foram tratadas com agente desmetilante (5-Aza) e o nível de expressão de ABI3 avaliado. Observamos a reexpressão de ABI3 nas linhagens de carcinoma folicular tratadas com 5-Aza (P<0,01). Desta forma, correlacionamos o nível de expressão de ABI3, com grau de metilação de seu promotor. Embora a análise in silico demonstrou que ABI3 não apresenta ilhas CpGs, identificamos a ocorrência de múltiplos sítios CpGs, adjacentes em seu promotor. Estas regiões, denominas regiões R1, R2 e R3, foram avaliadas. O grau de metilação da região R1 apresentou correlação inversa com a expressão de ABI3 nas células de CFT (P<0,05). Estes dados foram validados em amostras de CFT (n=17) e adenomas foliculares da tiroide (AFT) (n=11). Observamos uma hipermetilação de R1 nos CFT quando comparados aos AFT (P<0,001), o qual correlacionou com a expressão de ABI3 (P= 0,0002). Interessante, identificamos a presença de um sítio canônico para o fator 14 de transcrição tiroidiano NKX2-1 na R1, que flanqueia sítios CpGs. A análise da expressão de NKX2-1 revelou que ABI3 é expresso na presença de NKX2-1 e quando a região R1 encontra-se hipometilada. Os ensaios de Luciferase sugeriram que R1 pode ser um potencial enhancer. Nossos dados sugerem que a expressão de ABI3 nos tumores da tiroide parece ser regulada pelo grau de metilação de R1 no promotor de ABI3 associada a expressão de NKX2-1. Ainda, para melhor compreender os mecanismos moleculares envolvidos no papel de ABI3 no câncer de tiroide, nosso segundo objetivo foi investigar as vias de sinalização pelas quais ABI3 atua exercendo seu efeito supressor nos carcinomas da tiroide. Para isso, as linhagens celulares de carcinoma folicular da tiroide, WRO e FTC133, foram transfectadas com vetor de expressão contendo o cDNA Wild type de ABI3 e, controle negativo, o vetor vazio. Iniciamos pela identificação das vias de sinalização por Proteome Profiler Array, em que identificamos diversas vias já descritas como tendo papel em diversos tipos de câncer moduladas por ABI3, em especial, a via de AKT se mostrou enriquecida em nossas análises. Para melhor determinar a localização de ABI3 na via de sinalização, realizamos os ensaios de imunoprecipitação (IP) e espectrometria de massas que demonstraram que ABI3 faz parte do complexo regulatório WAVE (WRC) com as proteínas WAVE2 e CYFIP1. Para validação desses resultados as células foram tratadas com inibidor da via de AKT (LY294002). Além disso, foi gerado o mutante S342A de ABI3 por mutação sitio-dirigida e as vias reavaliadas por Western-Blot e IP. A determinação do sítio S342 foi realizada por análises in sílico com a ferramenta MotifScan. Pela primeira vez, nossos estudos com o inibidor de AKT e o mutante S342A mimético da forma não-fosforilada de ABI3, demonstraram que ABI3 é uma fosfoproteína, sendo diretamente fosforilada por AKT na S432 e que essa fosforilação provavelmente interfere na formação do complexo WRC. Os resultados foram observados em ambas as linhagens celulares. E a correlação entre ABI3 e as proteínas WAVE2 e CYFIP1 do complexo foi validada em amostras de pacientes (n=23) 15 com expressão de ABI3, AFT e tecido tiroidiano normal (P<0,05). Esses dados são inéditos na literatura, sugerindo uma relação entre a fosforilação de ABI3, AKT e a formação do complexo WRC. Ainda, esses dados sugerem uma possível via pela qual ABI3 atua exercendo seu efeito supressor, em especial, seus efeitos no crescimento e migração celular.