Caracterização de atividade ATPásica de Miosina V de cérebro de rato obtida por congelamento

• Autor(a) principal: Melo, Hugo Christiano Soares
• Data de Publicação: 2003
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFU
• Texto Completo: https://repositorio.ufu.br/handle/123456789/27192; http://dx.doi.org/10.14393/ufu.di.2003.23
• topic: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA; Miosina; Cérebro

Recentemente obtivemos uma fração enriquecida em atividade Mg2+-ATPásica a partir de citosol congelado de cérebro de rato. Nosso objetivo neste trabalho foi analisar esta ATPase e caracterizá-la. Nossos procedimentos foram extração de cérebro de rato, homogeneização imediata em tampão Imidazol-HCI 50 mM pH 8,0; EDTA 10 mM; DTT 1,0 mM e inibidores de proteases (Aprotinina 1% e Benzamidina 1 mM), centrifugação a 45000xg por 40 minutos a 4 °C e congelamento da fração solúvel a -20 °C. Após um mínimo de 48 horas descongelou-se essa fração e seguiu-se uma nova centrifugação a 45000xg por 40 minutos a 4 °C. Ressuspendeu-se a fração precipitada e realizou-se uma nova centrifugação, sob as mesmas condições supracitadas. A fração precipitada é enriquecida em atividade Mg2+-ATPásica e análise em SDS-PAGE mostrou três principais polipeptídeos, um com alta massa molecular similar a cadeia pesada de miosina e outros dois com massa molecular corrrespondente a 57 e 45 kDa. O polipeptídeo de alta massa molecular foi marcado com anticorpo especifico para miosina V. O polipeptídeo de 57 kDa foi solubilizado com Triton X-100 0,2%, encontrando-se no precipitado os polipeptídeos de alta massa molecular e o polipeptídeo de 45 kDa. A atividade Mg2+-ATPásica desse precipitado é três vezes menor que o precipitado obtido sem triton X-100. Nossa fração não mostrou estimulação da atividade Mg2+-ATPásica por Ca2+ e Calmodulina, tendo apenas uma baixa atividade K+/EDTA-ATPásica, quando comparada com a atividade Mg2+-ATPásica. A atividade Ca2+-ATPásica foi cerca de 80% da atividade Mg2+-ATPásica. Também não ocorreu alteração da atividade Mg2+-ATPásica por cloreto de alumínio, fluoreto de sódio ou fluoreto de alumínio. Vanadato (50, 200 e 1000 pM) ou azida (1 mM) também não inibiu essa atividade. Essa fração apresentou preferência de hidrólise para ATP, entretanto hidrolisou também ADP (40%) e GTP (60%), mas não AMP, AMP-PNP, PPj, ADP2’5'3,5 AMP-PNP inibiu a atividade Mg2+-ATPásica. A atividade Mg2+-ATPásica foi inibida cerca de 50% por Fe2+ numa concentração menor que 1 mM, mas não pelos cátions cobre, cobalto ou zinco. A digestão protéica por tripsina causou uma perda da atividade e uma degradação do polipeptídeo de alta massa molecular, mantendo intacto o polipeptídeo de 45 kDa em nossa fração. Nesse trabalho descrevemos um método simples para obter miosina V a partir de uma fração solúvel de cérebro de rato no entanto não foi estimulada por Ca2+/Calmodulina e não expressou atividade K+/EDTA-ATPásica.