Purificação, caracterização bioquímica e atividade antimicrobiana de peptídeos de semente de soja (Glycine max [L.] Merryll)

• Autor(a) principal: Nascimento, Danielle Gomes
• Data de Publicação: 2003
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: LOCUS Repositório Institucional da UFV
• Texto Completo: http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/8770
• topic: Peptídeo antimicrobiano; Soja; Fungos fitopatogênicos; Espectrometria de massa; Ciências Biológicas

As doenças infecciosas estão entre as principais causas de morte da população humana. Esse fato é causado, em grande parte, pelo surgimento de microrganismos multi-resistentes aos antibióticos. Portanto, apesar da disponibilidade de um grande número de antibióticos de última geração, torna-se ainda fundamental buscar compostos que possam atuar como novas drogas a serem utilizadas no combate as doenças infecciosas. Em plantas, a atividade antimicrobiana pode ser demonstrada por vários tipos de moléculas, como as proteínas relacionadas com a patogenicidade, os componentes orgânicos das plantas, as famílias de peptídeos antimicrobianos e as espécies ativas de oxigênio e nitrogênio. Atualmente, peptídeos antimicrobianos de origem vegetal estão sendo utilizados como modelos para o desenho de novas drogas com aplicação nas áreas agrícolas e de saúde. Deste modo, nosso trabalho objetivou a determinação da metodologia mais eficaz para a purificação dos peptídeos catiônicos, presentes em sementes maduras de soja, com atividade antimicrobiana ou outras, e a caracterização bioquímica destes peptídeos visando à obtenção de informações de importância para a elucidação de suas funções biológicas. Os peptídeos de semente madura de soja foram extraídos, na proporção de 1:5 (gramas semente : mL tampão), em tampão fosfato de sódio 25 mM, pH 7,4, contendo KCl 100 mM, EDTA 2 mM, PVP 1,5% (p/v), tiouréia 2 mM, PMSF 1 mM e benzamidina 1 mM por homogeneização do extrato durante 2 h a 4 °C, em banho de gelo. O extrato obtido foi centrifugado a 20.300 x g a 4 °C e o sobrenadante obtido após o final da extração foi fracionado com sulfato de amônio sólido 35% sat. e centrifugado sob as mesmas condições. O sobrenadante foi aquecido a 80°C por 15 min e novamente centrifugado sob as mesmas condições. Após a diálise do extrato em membrana de exclusão de 1.000 Da, foram realizadas as cromatografias de troca aniônica, em coluna DEAE- Sepharose equilibrada com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8,0; a de exclusão molecular, em coluna Superdex Peptide equilibrada com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, contendo 150 mM de NaCl; e a de fase reversa, em coluna C 18 equilibrada com acetonitrila 80% e TFA 0,1%, para obtenção dos peptídeos catiônicos purificados. A análise em espectrômetro de massa das frações eluídas do HPLC indicou a presença de compostos de massas moleculares menores do que 500 Da, 678,61 Da e 700,60 Da, a presença de peptídeos com massas moleculares de 5.809,11 Da, 8.526,97 Da e 14.113,18 Da. A seqüência de aminoácidos do peptídeo de 5.809,11 Da foi determinada e mostrou alta homologia com as cadeias B da pró-insulina humana e de vários outros organismos, da insulina bovina e da insulina de feijão-de-porco (Canavalia ensiformes). Os compostos presentes em dois pools eluídos da cromatografia de exclusão molecular, pool 2 e pool 3, inibiram o crescimento da bactéria Gram-negativa Ralstonia solanacearum, enquanto que, para a bactéria Gram-positiva Clavibacter michiganensis, somente o pool 3 exerceu alguma ação, mas com a inibição do crescimento muito menor do que a obtida para a Ralstonia solanacearum. Assim, estes compostos apresentam potencial antimicrobiano a ser explorado na indústria agrícola.