Characterization of Klebsiella spp from healthy swine: virulence, resistance to antimicrobials and gene transferer mediated by extracellular vesicles

• Autor(a) principal: Rosa, Jéssica Nogueira
• Data de Publicação: 2023
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: eng
• Título da fonte: LOCUS Repositório Institucional da UFV
• Texto Completo: https://locus.ufv.br//handle/123456789/31480; https://doi.org/10.47328/ufvbbt.2023.476
• topic: Intestinos - Microbiologia; Suínos - Fisiologia; Bactérias patogênicas; Marcadores genéticos; Microbiologia Agrícola

Bactérias do gênero Klebsiella pertencem à família Enterobacteriaceae, são Gram-negativas e exibem diferentes habitats e funções ecológicas, especialmente em diferentes hospedeiros. A espécie mais estudada é Klebsiella pneumoniae uma bactéria encontrada naturalmente na microbiota intestinal e importante patógeno oportunista. Os fatores de virulência atribuídos a K. pneumoniae são produção e secreção de sideróforos, fímbrias do tipo I e III, cápsula polissacarídica, lipopolissacarídeos (LPS), sistema de secreção (T6SS) e vesículas extracelulares (EVs). Fatores envolvidos com virulência e resistência a antimicrobianos são variáveis e codificados por diferentes genes. Esses genes podem ser adquiridos por transferência horizontal (THG) com a participação efetiva de elementos genéticos móveis (MGE), como plasmídeos e elementos integrativos conjugativos (ICE). Suínos apresentam Klebsiella spp como membros da microbiota intestinal, e podem ser reservatórios deste gênero com marcadores genéticos de virulência e resistência. Diante disso, este trabalho teve como objetivos: isolar Klebsiella spp de suínos saudáveis em fase de crescimento II; caracterizar o fenótipo e o genótipo de virulência e de resistência a antimicrobianos; investigar a contribuição de ICEs para seu nicho ecológico assim como, a transferência horizontal de genes mediada por vesículas extracelulares (EVs). Como resultados do capítulo 1, foram obtidos 144 isolados de Klebsiella spp, destes 77 % identificados como K. pneumoniae, 14,5 % Klebsiella aerogenes e 8,5% Klebsiella variicola. Nos isolados obtidos foram observados o seguinte perfil de resistência: β-lactâmicos (100 %), cefalosporinas (75,5 %), fluoroquinolonas (51 %), fenicol (48,8 %), tetraciclina (55,5 %), macrolídeo (37,7%), sulfonamida (35,5 %), aminoglicosideo (8,8%), trimetoprim (4,5 %). No geral, 88,8 % dos isolados foram caracterizados como multirresistentes a antimicrobianos (MDR). Importantes fenótipos e genótipos de virulência foram identificados como produção de sideróforos (entB, iucB, iutA, kfu e ybtS/irp2) e biofilme, onde 39 % são classificados como produtores fortes, 45 % moderados e 16 % como produtores fracos. O fenótipo hipermucoviscoso não foi verificado nos isolados investigados, no entanto o gene marcador iutA foi identificado em 19 isolados (42,2 %). A partir dos resultados apresentados, 11 isolados de K. pneumoniae MDR foram selecionados para investigação do tipo de sequência (STs) e os mesmos foram classificados como: ST25, ST147, ST616, ST691 e ST6208. Desta forma, dois isolados foram selecionados para o sequenciamento de genomas (capítulo 2), K. pneumoniae HS-144 e K. pneumoniae HS-13. A anotação funcional revelou classes como metabolismo de carboidratos, aminoácidos e proteínas (37,6%); transporte de membrana (5,7%); regulação e sinalização celular (3,5%); metabolismo de DNA (3,5%); virulência, doença e defesa (3,1%); parede celular e cápsula (5,2%) e outros. Klebsiella pneumoniae HS-144 e K. pneumoniae HS-13 carregam plasmídeos. Das duas linhagens, somente na linhagem HS-144 foram identificados genes envolvidos com o aparato de conjugação completo (T4SS, T4CP, relaxase e oriT), e um fago que transporta o gene blaSHV2. Para esta linhagem (HS-144) ainda foi confirmado o fenótipo ESBL - β-lactamase de espectro estendido. Assim, um ensaio de conjugação biparental utilizando a K. pneumoniae HS-144 como doadora e E. coli J53 como receptora (seleção com colistina). Foram obtidos três transconjugantes (MIC para colistina de >64mg.mL-1), confirmando a natureza mobilizável de determinantes genéticos envolvidos com resistência à colistina, um fármaco utilizado como último recurso em tratamentos de K. pneumoniae na clínica humana. No capítulo 3, foram investigados 949 genomas completos de K. pneumoniae visando a caracterização de elementos integrativo e conjugativo na espécie. De todos os genomas analisados, 501 genomas apresentaram uma ou mais regiões potenciais com capacidade de auto transferência, sendo que 18,2% destes apresentam coocorrências com outros ICEs. Detectamos 19 novos candidatos a ICEs. Os novos ICEs carregam genes relacionados à adesão e absorção de ferro, biossíntese da cápsula, parede celular e LPS, resposta ao estresse, componentes da membrana e resistência ao arsênico, β-lactâmico, polimixina e novobiocina. Além disso, também mapeamos quatro novos ICEs que carregam a ilha altamente patogênica de Yersinia (HPI). No capítulo 4, investigamos a importância das vesículas extracelulares (EVs) na transferência de genes entre Klebsiella spp de origem humana e de suino. As EVs-Kp13 (K. pneumoniae Kp13) foram obtidas pelo método de filtração hidrostática. As EVs obtidas apresentaram tamanho médio de 182 nm e morfologia arredondada. Neste trabalho foi confirmado que as EVs-Kp13 carreiam genes de resistência a sulfonamida (sul2), cefalosporinas (blaCTXM2, blaSHV, blaTEM), cabapenemos (blaKPC) e trimetoprim (dfrA15). Além disso, foi detectado que as EVs-Kp13 carreiam genes que codificam para o sideróforo yersiniabactina. Nossos resultados de vesidução foram positivos quando utilizada a linhagem K. aerogenes 270 como receptora, isolada de suíno saudável. Foram obtidos quatro transvesidantes que apresentaram resistencia para cefalosporinas (terceira e quarta geração) e trimetoprim, além dos genes marcadores do plasmídeo pKP13f. Podemos concluir que suínos clinicamente saudáveis apresentam Klebsiella spp com fenótipo MDR e de virulência relevantes, do ponto de vista clínico, em sua microbiota normal. Klebsiella pneumoniae pode ainda carregar elementos genéticos móveis como plasmídeos e ICEs que auxiliam seu fitness em diferentes ambientes. E por fim, a vesidução pode ser um importante meio de disseminação de genes de resistência em Klebsiella spp. Esse estudo elucida importantes rotas de fluxo gênico entre espécies e reservatórios diferentes contribuindo expressivamente para a abordagem da saúde unificada. Palavras-chave: One health. Multirresistência. Fitness microbiano. Vesidução.