Expressão heteróloga e caracterização bioquímica e biológica da NTPDase-1 de Leishmania infantum chagasi

• Autor(a) principal: Bastos, Matheus Silva e
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: LOCUS Repositório Institucional da UFV
• Texto Completo: http://locus.ufv.br/handle/123456789/2435
• topic: NTPDase-1; Leishmania; Expressão heteróloga; NTPDase-1; Leishmania; Heterologous expression; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::BIOLOGIA MOLECULAR

A Leishmaniose Visceral (LV) é um grave problema de saúde pública em vários países do mundo incluindo o Brasil. Atualmente tem se observado um número crescente de casos no homem e no cão, sendo este último considerado principal reservatório doméstico responsável pela manutenção da doença em periferias de grandes cidades. O foco central deste trabalho é o estudo da NTPDase-1 de Leishmania infantum chagasi, agente etiológico principal da LV no Brasil. A NTPDase-1 faz parte da família das E-NTPDases, que são enzimas implicadas como fatores de virulência de alguns parasitos. Elas participam da via de salvação de purinas e da modulação da resposta imune do hospedeiro dependente de nucleotídeos extracelulares. Essas enzimas constituem importantes alvos para o desenvolvimento de novas drogas e vacinas para as leishmanioses, tanto humana quanto canina. Neste trabalho foram feitas análises de bioinformática das E-NTPDases de Leishmania braziliensis, L. infantum, L. major, Trypanosoma brucei e T. cruzi. Além disto, foi feita a clonagem, expressão em sistema bacteriano, purificação e caracterização enzimática da porção solúvel da NTPDase-1de L. infantum chagasi. A enzima purificada foi usada também para produção de anti-soro policlonal anti-NTPDase-1. Foram feitos testes de crescimento de L. braziliensis, onde foi feito tratamento com a NTPDase-1 recombinante durante o cultivo celular. Nas análises de bioinformática foi possível observar a existência de dois grupos, as NTPDases-1 e NTPDases-2. Os dados demonstram que existem conservações específicas entre enzimas do mesmo grupo, como sítios de glicosilação e predição de localização subcelular onde a maioria das isoformas-1 são preditas como secretadas e as isoformas 2 como presentes na membrana. Foram observadas algumas possíveis pontes dissulfeto conservadas em todas as sequências. Quanto as características bioquímicas, baseado em dados já existentes, viu-se clara distinção de preferência por substrato entre as enzimas dos diferentes grupos, e duas enzimas (L.i NTPDase-2 e L. m NTPDase-2), muito próximas no agrupamento, apresentam hidrólise comum para a maioria dos substratos. Quando é comparada a NTPDase-1 de T. cruzi e a de L. infantum chagasi, caracterizada neste trabalho, observa-se que o pH de atividade máxima é distinto: a enzima de T. cruzi apresenta atividade maior em pH básico (7,5- 8) e a NTPDase-1 de L. infantum chagasi em pH ácido (5,5-6,0). A L. i NTPDase-1 apresentou especificidade para GTP enquanto as outras enzimas de tripanosomatídeos hidrolisam vários nucleotídeos tri e di-fosfatados. Nas análises o efeito biológico da adição da L.i NTPDase-1 em cultura axênica de promastigotas de L. braziliensis, verificou-se uma possível influência na metaciclogênese in vitro . Todos os dados são discutidos em termos de possíveis papéis da L.i NTPDase-1 na biologia de L. infantum chagasi e na infecção do vetor e do hospedeiro, abrindo novas perspectivas de estudos na área. Os dados obtidos sugerem que esta enzima pode influenciar de no mecanismo de metaciclogênese por algum processo ainda não conhecido.