A função do chaperone molecular BiP na resposta a estresses abióticos

• Autor(a) principal: Miguel, Larissa Pereira
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: LOCUS Repositório Institucional da UFV
• Texto Completo: https://locus.ufv.br//handle/123456789/29122
• topic: Chaperonas moleculares; Plantas - Desenvolvimento; Fisiologia vegetal; Stress (Fisiologia); Balanço hidrológico; Ciências Biológicas

A manutenção da homeostase em organismos vivos passa por mecanismos de percepção e propagação dos mais diversos sinais dentro da célula e do organismo como um todo por meio de complexas redes de sinalização.Vias de sinalização em planta possuem, muitas vezes, o papel de minimizar os efeitos deletérios de estresses bióticos e abióticos,por meio da ativação e repressão de genes específicos. Estes estresses são responsáveis por prejudicar o desenvolvimento e levar a perdas na produção. Desta maneira, diferentes estudos têm focadoem elucidar estasvias de sinalização com a finalidade de obter cultivares superiores. Dentre estas, a via de resposta a proteínas mal dobradas (UPR) e a via mediada por proteínas ricas em asparaginas (NRPs), que transduzem sinais de morte celular originados de estresse no retículo endoplasmático (RE) e osmótico, exercem um papel de atenuação dos estresses e alterações relacionadas ao desenvolvimento. A chaperona molecular residente do RE, BiP, foi demonstrada retardar a indução de morte celular em condições de estresse ea senescência natural,regulando, assim, ambas as vias de sinalização. No entanto, o mecanismo pelo qual BiP controla estas vias é totalmente desconhecido. Desta forma, osobjetivos do presente trabalho foram(I) avaliar o papel do domínio ATPase e da atividade chaperona de BiP no processo de modulação das vias de resposta a estresses no RE, osmótico e de morte celular programada (II) Identificar possíveis candidatos moduladores supressores do mecanismo de tolerância à seca mediado por BiP. Foram geradas mutações no gene de BiPD no sítio de hidrólise do ATP (T44G) e no sítio de ligação ao ATP (G233D), com o propósito de demonstrar se a região chaperona de BiP influência na sua modulação das vias de sinalização. A partir destes mutantes, diferentes técnicas foram utilizadas para demonstrar que estas mutações levaram à perda de função de BiP. Experimentos de estresse hídrico foram realizados demonstrando que as plantas transformadas com o gene mutado ficaram mais susceptíveis à morte celular. Através do tratamento com tunicamicina (indutor de estresse no RE), o nível de expressão de genes da UPR aumentou nas plantas BiPD-T44G e BiPD-G233D, além do fenótipo de morte celular ter sido mais agravante comprovado pelo experimento de Azul de Evans e de infiltração. Além disso, o comportamento da indução de genes NRPs foi alterado nestas plantas, uma vez que houve um aumento da indução destes genes quando comparados com a planta superexpressando BiP. Os resultados obtidos indicam que a função chaperone de BiP está relacionada com a forma que BiP atua em resposta a estresse hídrico e estresse no RE. De forma a identificar possíveis moduladores do mecanismo de tolerância mediado por BiP, foram realizadas mutações com EMS em plantas superexpressando BiPD, e por meio do sequenciamento do genoma das mesmas foram selecionados possíveis supressores do mecanismo de tolerância à seca de BiP. Dentre os genes identificados, ZAR1 foi selecionado para estudo.Primeiramente foi demonstrado que ZAR1 apresenta expressão aumentada em plantas superexpressando BiPD. Além disso, foram obtidas plantas superexpressando e silenciadas para o gene ZAR1. Ensaio de infiltração de tunicamicina em Arabidopsisthalianamostrou que plantas superexpressando ZAR1 apresentam menor grau de clorose decorrente do processo de morte celular, enquanto que em plantas knock-down para ZAR1 este processo foi acelerado. Estudos mostraram que o regulador de proteína G, RGS1, possui função de dessensibilizar a sinalização mediada por proteína G, além de estar envolvido na regulação em resposta à seca. Este mecanismo ainda não é totalmente conhecido, entretanto foi identificado queproteínas LRRRLK são responsáveispela fosforilação de RGS1 ativando sua modulação das proteínas G. ZAR1 possui sítio de ligação à proteína G e pertence à família das LRRRLK, desta maneira ensaio de co-imunoprecipitação e ensaio de complementação de fluorescência bimolecular foram realizados e, a interação entre ZAR1 e RGS1 foi provada.No entanto, posteriores estudos precisam ser realizados para identificar o mecanismo envolvido nesta interação, além de qual resposta é desencadeada após essa interação. Estes resultados indicam uma correlação direta entre ZAR1 e morte celular induzida por tunicamicina e apontam favoravelmente para um envolvimento direto de ZAR1 como supressor do mecanismo de ação de BiP.