Organização do gene de pectina liase em Penicillium expansum e obtenção de linhagens recombinantes de Penicillium griseoroseum com alta produção de pectina liase

• Autor(a) principal: Cardoso, Patrícia Gomes
• Data de Publicação: 2004
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: LOCUS Repositório Institucional da UFV
• Texto Completo: http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/10691
• topic: Transformação; Biotecnologia; Penicillium expansum; Penicillium griseoroseum; Pectinases; Ciências Agrárias

A seqüência de nucleotídeos contendo o gene ple1 que codifica pectina liase em Penicillium expansum foi clonada. Esta seqüência contém 874 nucleotídeos da região promotora, 1342 nucleotídeos da região codificadora e 469 nucleotídeos da região terminadora. A região codificadora do gene ple1 é interrompida por dois íntrons, de 101 e 116 nucleotídeos, confirmados pela seqüência do cDNA. Na seqüência da região promotora de ple1 foi observado cis-elementos envolvidos na regulação da expressão desse gene, como TATA box (TATATAA) na posição -91 do códon de início da tradução, sendo esta seqüência precedida por uma região rica em pirimidinas e CAAT box (CCAATT) a -568 do códon de inicio da tradução. A proteína PLE1, deduzida a partir da seqüência de nucleotídeos possui 374 resíduos de aminoácidos, com massa molecular estimada de 40,1 KDa e pI calculado de 9,46. Análise por hibridização do DNA total de P. expansum e P. griseoroseum com um fragmento de DNA de 2,1 Kb que corresponde ao gene pelA de A. niger, indicou organização semelhante dos genes de PL no genoma destes fungos. A expressão do gene ple1, avaliada pela hibridização do RNA total com um fragmento de DNA que corresponde à região estrutural do gene ple1 mostrou que o transcrito foi detectado durante todo tempo de cultivo em presença de pectina. No entanto, quando cultivado em presença de sacarose, o transcrito somente foi detectado em 12 e 24 horas de cultivo, com adição de extrato de levedura. A caracterização morfológica de P. expansum e P. griseoroseum mostrou diferenças nítidas tanto no diâmetro quanto na coloração do verso das colônias destes fungos. Diferenças na organização da região subtelomérica dos cromossomos de P. expansum e P. griseoroseum, foram observadas quando o plasmídeo pTEL13 foi utilizado como sonda. A região ITS do rDNA de P. expansum tem 600 pb e de P. griseoroseum 594 pb. As linhagens transformantes obtidas com os plasmídeos pPlg1 e pNPG1, apresentaram aumentos na atividade de PL de no máximo 3 vezes. Análise por hibridização do DNA total dos transformantes indicou a ocorrência de integrações homólogas e heterólogas de pelo menos duas cópias do gene plg1. Foi construído um vetor de expressão, denominado pAN52-Plg1 que continha o gene plg1 sob o controle do promotor forte constitutivo do gene (gpdA) de A. nidulans. A transformação da linhagem mutante PG63 utilizando este vetor e o pNPG1, resultou na obtenção de uma linhagem recombinante (105) com aumento de 58 vezes na atividade de PL, quando cultivada em presença de glicose como fonte de carbono. Seis linhagens recombinantes foram avaliadas por hibridização apresentando integração heteróloga de mais de uma cópia do gene plg1 no genoma. Avaliação das proteínas extracelulares por eletroforese (SDS-PAGE) mostrou a presença de uma banda nítida e forte de aproximadamente 40 KDa presente no sobrenadante de cultivo da linhagem recombinante 105 que corresponde a PLG1. A atividade específica aparente de PL sintetizada por esta linhagem foi 44 e 27 vezes maior do que aquela obtida para linhagem mutante PG63 e de uma preparação comercial de pectinases “Citrus Clear”, respectivamente. O cultivo da linhagem recombinante 105 em meio contendo caldo de cana promoveu uma atividade de PL 132 vezes maior do que a atividade obtida pela linhagem PG63 cultivada nesta mesma fonte de carbono. A atividade de PL da linhagem recombinante 105, cultivada em diferentes volumes de meio, aumentou linearmente com o tempo. Pectina cítrica, quando utilizada como substrato, promoveu maior atividade de PL. A enzima mostrou ser estável em ampla faixa de pH e temperatura de armazenamento. Estes resultados mostram que a linhagem recombinante 105 é promissora para produção de PL em escala industrial, principalmente, para aplicação na indústria de sucos e vinhos, onde o emprego apenas da PL apresenta várias vantagens na qualidade do produto final.