Ensaios de interação proteína-proteína revelam funções similares de proteínas em diferentes espécies de plantas e patógenos

• Autor(a) principal: Euclydes, Nívea Costa
• Data de Publicação: 2023
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: LOCUS Repositório Institucional da UFV
• Texto Completo: https://locus.ufv.br//handle/123456789/32019; https://doi.org/10.47328/ufvbbt.2023.756
• topic: Marcadores genéticos; Morte celular; Proteínas; Ligações químicas; Biologia Molecular

Raramente, as proteínas funcionam como formas monoméricas e, frequentemente, exercem suas funções como dímeros ou por meio de interações com outras proteínas (heterodímeros ou oligômeros). Estas interações proteína-proteína são particularmente relevantes em vias de sinalização celulares em que os sinais percebidos por receptores são propagados intracelularmente por meio de interações proteína-proteína. A via de sinalização de morte celular mediada por proteínas DCD/NRPs (“Development and Cell Death Domain-containing N-Rich Proteins”) tem sido caracterizada em soja e representa um importante circuito de sinalização que liga senescência foliar natural com aquela induzida por estresses e pode conferir às plantas tolerância à seca. Exceto por GmNAC30 cujo ortólogo de Arabidopsis ainda não foi identificado, os demais componentes da via em soja, NRP-A, NRP-B, GmNAC81, VPE possuem ortólogo caracterizados em Arabidopsis, AtNRP1, AtNRP2, ANAC36 e gamaVPE, respectivamente. GmNAC30 pertence à família SNACA, compartilhando maior grau de conservação de sequência com ATAF2 de Arabidopsis. Sendo assim, o presente estudo propôs investigar, como primeiro objetivo, a possível participação de AtATAF2 na via de morte celular programada mediada por NRPs, como o ortólogo de GmNAC30. Por meio de ensaios de duplo híbrido em leveduras e BiFC em folhas de Nicotiana benthamiana, foi demonstrado que ATAF2 interage com ANAC36 de uma forma específica e, como GmNAC30, também interage com GmNAC81. Estes resultados sugerem que ATAF2 é provavelmente o parceiro natural de ANAC36 na indução da expressão de VPE. Além disso, ATAF2 é localizado no núcleo e exibe atividade transcricional em leveduras, propriedades bioquímicas próprias de GmNAC30. Dentre os patógenos de plantas economicamente importantes, os geminivírus destacam-se por sua ampla ocorrência no mundo e pela variedade de hospedeiros. Begomovírus constitui o maior gênero da família Geminiviridae, cujas espécies são transmitidas pela mosca branca e representam uma restrição severa à agricultura globalmente. Similarmente a outros vírus, os begomovírus formam rede de interações proteína-proteína entre proteínas virais e do hospedeiro. Recentemente, foi identificado o interactoma entre proteínas virais e do hospedeiro, o qual revelou um “hub” de interação proteína-proteína enriquecidos por proteínas que respondem à auxina. Embora estes resultados sugiram que a sinalização por auxina possa ser funcionalmente relevante durante a infecção por begomovírus, é necessário que estas interações sejam comprovadas por métodos alternativos de interação proteína-proteína. Sendo assim foi selecionado um representado do hub AT4G14560 que interage com ambas as proteínas virais NSP e MP a fim de se confirmar estas interações por ensaio de duplo-híbrido em leveduras. Foi demonstrado que AT4G14560 fusionada ao domínio de ativação (AD) de GAL-4 interage com NSP fusionada ao domínio de ligação (BD) de GAL-4, promovendo autotrofia a His quando coexpressas em leveduras. Assim também BD-AT4G14560 interage com AD-MP em leveduras. As interações foram específicas já que as combinações das proteínas fusionadas com vetores vazios não promoveram autotrofia à histidina em leveduras cotransformadas. Estes resultados validam os resultados de arranjo de proteínas e confirmam o possível envolvido de auxina na infecção viral, o que deverá ser investigado posteriormente. Um hub funcional bem definido do sistema imune de plantas corresponde a interconexões convergentes para a proteína CSN5A, para a qual convergem proteínas de patógenos divergentes, como C2 de geminivírus. Este hub também é enriquecido de proteínas de defesa de plantas. Considerando que a proteína AtWWP1 possui atividade antiviral contra geminivírus, foi de interesse verificar a proteína AtWWP1 também faz parte do hub imune derivado de CSN5A. Inicialmente, por meio do sistema duplo-híbrido de leveduras, foi examinada a possível interação das proteínas CSN5A e AtWWP1. A interação entre as respectivas proteínas em leveduras foi confirmada pela ativação do gene repórter LacZ, quantificado pela atividade da enzima β-galactosidase, e autotrofia à histidina em leveduras transformadas com as combinações CSN5A-BD e AtWWP1-AD, mas não em leveduras transformadas pelas combinações com vetores vazios. Além disso, a interação entre as proteínas CSN5A e AtWWP1 foi monitorada in vivo por meio dos ensaios de co- imunoprecipitação e BiFC. Nos experimentos de Co-IP, o anticorpo anti-GFP imunoprecipitou separadamente a proteína CSN5A-GFP e GFP, sendo que a proteína AtWWP1-HA foi detectada somente no imunocomplexo de CSN5A-GFP, confirmando associação estável e específica entre as proteínas AtWWP1 e CSN5A nos extratos protéicos de folhas de N. benthamiana transformadas com as respectivas construções. Nos ensaios de BiFC, coexpressão de AtWWP1 fusionada ao C-terminal de YFP e CSN5A fusionada ao N-terminal de YFP e vice-versa, promoveu a reconstituição de fluorescência no núcleo de células de folhas de N. benthamiana, mas não os controles negativos. Coletivamente, esses resultados demonstram que CSN5A e AtWWP1 interagem in vivo no núcleo de células vegetais. Estes resultados também reforçam o argumento de que o hub imune CSN5A é funcional durante a infecção por geminivírus. Palavras-chave: interação proteína proteína; patógenos de plantas; hub imune CSN5A.