Isolamento, criopreservação e utilização de células do cordão umbilical, células do tecido adiposo e células do líquido amniótico para produção de embriões bovinos por transferência nuclear (clonagem)

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Silva, Carolina Gonzales da
Data de Publicação: 2013
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio.unb.br/handle/10482/13593
Resumo: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2013.
id UNB_07d3a084418e86ba55d712c8ee18e033
oai_identifier_str oai:repositorio.unb.br:10482/13593
network_acronym_str UNB
network_name_str Repositório Institucional da UnB
repository_id_str
spelling Isolamento, criopreservação e utilização de células do cordão umbilical, células do tecido adiposo e células do líquido amniótico para produção de embriões bovinos por transferência nuclear (clonagem)GadoCélulas-troncoCordão umbilicalDissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2013.A clonagem por transferência nuclear (TN) ainda é uma técnica com baixa eficiência em bovinos. Um dos fatores que deve ser melhorado é a fonte de células doadoras de núcleo. Quanto menos diferenciadas forem estas células, mais facilmente elas serão reprogramadas pelo citoplasma receptor, a fim de originarem embriões e bezerros a termo de uma forma saudável. Células do fluido amniótico (CFA), da geleia de Wharton do cordão umbilical (CGW) e do tecido adiposo (CTA) são fontes de células multipotentes com potencial para uma melhor reprogramação e que ainda não haviam sido testadas para a produção de embriões bovinos por meio de TN. O objetivo deste trabalho foi isolar, cultivar, criopreservar e utilizar no procedimento de TN as CFA, CGW e CTA de bovinos. Primeiramente, foram isoladas CFA de úteros de abatedouro para testar o melhor meio de cultivo (DMEM vs Amniomax Complete II), e o melhor agente crioprotetor (glicerol vs DMSO vs DMF) quanto a preservação de viabilidade celular avaliada por azul de Trypan 0,4%. Posteriormente, testou-se a possibilidade de isolamento in vivo dos tipos celulares. O cultivo foi feito por centrifugação das CFA e explante das CGW e CTA. Para comparação morfológica foi realizada a Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) das células em cultivo. Para avaliação de integridade de DNA realizou-se a metodologia de TUNEL. Para a análise estatística foi realizada ANOVA seguida de teste de Tukey (p<0,05). O meio Amniomax Complete II apresentou crescimento e confluência das CFA em todos os materiais isolados de quatro animais. O DMSO e o glicerol preservaram uma maior porcentagem de células (84,50±9,53% e 63,00±18,18%, respectivamente), e foram superiores ao meio com DMF (42,00±13,92%). Obteve-se êxito no isolamento in vivo dos tipos celulares, por meio de aspiração intravaginal guiada por ultrassom no caso das CFA, coleta do cordão umbilical no momento do parto para as CGW e coleta de biópsia de animal jovem para as CTA. A avaliação de TUNEL revelou 100% de células com DNA íntegro para os três tipos celulares em primeira passagem. As micrografias em MEV revelaram CTA em padrão fusiforme de crescimento e CFA e CGW sem forma definida sob cultivo. Houve diferença significativa nas taxas de eletrofusão, com resultados superiores para CFA e CGW (85,89±9,93% e 69,64±11,72%, respectivamente), em relação às CTA (50,07±10,64%). A produção embrionária não diferiu estatisticamente entre os três tipos celulares (46,47±7,92%, 45,46±13,03% e 62,67±15,15%, para CTA, CFA e CGW, respectivamente), entretanto observou-se uma superioridade de aproximadamente 17% na produção de blastocistos para CGW em relação a CTA e CFA. Foram obtidas gestações de todos os tipos celulares, mas somente uma gestação veio a termo, proveniente de TN com CFA, e uma gestação encontra-se aos 200 dias, proveniente de CTA. O animal nascido por secção cesariana veio a óbito logo após o parto por insuficiência respiratória. Demonstrou-se ser possível isolar, cultivar e criopreservar CFA, CGW e CTA de bovinos vivos sem prejudicá-los e produzir embriões por meio de TN com eficiência utilizando esses tipos celulares. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACTCloning by nuclear transfer (NT) is still a technique with low efficiency in cattle. One of the factors that should be improved is the source of nucleus donor cells. The less differentiated are the cells, the easier is to reprogram their nuclei by cytoplasm receiver in order to originate healthy embryos and calves. Cells from amniotic fluid (CAF), Wharton's jelly of the umbilical cord (CWJ) and adipose tissue (CAT) are sources of multipotent cells with potential for improve reprogramming and that had not been tested for the production of bovine embryos by NT. The aim of this study was to isolate, cultivate, cryopreserve and utilize in the NT procedure, the CAF, CWJ and CAT of bovine. Firstly, CAF of uteri obtained from slaughterhouse were isolated to test what is the best medium for in vitro culture (DMEM vs Amniomax Complete II), and the best cryoprotectant agent (glycerol vs DMSO vs DMF), as the preservation of the cell viability assessed by Trypan Blue 0,4%. Subsequently, the possibility of isolating in vivo the described cell types was tested. The culture was done by centrifugation of CAF and explantation of CWJ and CAT. For morphological comparison, scanning electron microscopy (SEM) of the cells in culture was performed. For evaluating DNA integrity, the TUNEL method was carried out. For the statistical analysis was performed ANOVA followed by Tukey test (p<0,05). The medium Amniomax Complete II presented growth and confluence of the CAF in all material isolated from four animals. The DMSO and glycerol preserved a higher percentage of cells (84.50±9.53% and 63.00±18.18%, respectively), and were superior to medium with DMF (42.00±13.92%). Success was obtained in the isolation of cell types in vivo through use intravaginal ultrasound- guided aspiration for CAF, collection from the umbilical cord at birth for CWJ and by collecting biopsy from young animal for CAT. The evaluation of TUNEL revealed 100% of cells with intact DNA for the three cell types in the first passage. The SEM micrographs revealed a fusiform growth of CAT, and CAF and CGW without defined form under culture. There were significant differences in the rates of electrofusion, with results superior for CAF and CWJ (85.89±9.93% and 69.64±11.72%, respectively), relative to CAT (50.07±10.64%). The embryo production did not differ significantly among the three cell types (46.47±7.92%, 45.46±13.03% and 62.67±15.15% for CAT, CAF and CWJ, respectively), however a superiority of 17% in blastocyst production of CWJ in relation to the CAT and CAF was observed. Pregnancies were obtained for all cell types, but only one pregnancy has come to term, from TN with CAF and one gestation is on day 200 from the CAT. The born calf died soon after birth by cesarean section, due respiratory insufficiency. This study proved it is possible to isolate, cultivate and cryopreserve CAF, CAT and CWJ from live animals without harming them and to produce bovine embryos by TN efficiently using these cell types.Instituto de Ciências Biológicas (IB)Programa de Pós-Graduação em Biologia AnimalBáo, Sônia NairSilva, Carolina Gonzales da2013-07-17T19:53:20Z2013-07-17T19:53:20Z2013-07-172013-02-21info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfSILVA, Carolina Gonzales da. Isolamento, criopreservação e utilização de células do cordão umbilical, células do tecido adiposo e células do líquido amniótico para produção de embriões bovinos por transferência nuclear (clonagem). 2013. xv, 83 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Animal)—Universidade de Brasília, Brasília, 2013.http://repositorio.unb.br/handle/10482/13593A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2024-01-31T17:16:10Zoai:repositorio.unb.br:10482/13593Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2024-01-31T17:16:10Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
dc.title.none.fl_str_mv Isolamento, criopreservação e utilização de células do cordão umbilical, células do tecido adiposo e células do líquido amniótico para produção de embriões bovinos por transferência nuclear (clonagem)
title Isolamento, criopreservação e utilização de células do cordão umbilical, células do tecido adiposo e células do líquido amniótico para produção de embriões bovinos por transferência nuclear (clonagem)
spellingShingle Isolamento, criopreservação e utilização de células do cordão umbilical, células do tecido adiposo e células do líquido amniótico para produção de embriões bovinos por transferência nuclear (clonagem)
Silva, Carolina Gonzales da
Gado
Células-tronco
Cordão umbilical
title_short Isolamento, criopreservação e utilização de células do cordão umbilical, células do tecido adiposo e células do líquido amniótico para produção de embriões bovinos por transferência nuclear (clonagem)
title_full Isolamento, criopreservação e utilização de células do cordão umbilical, células do tecido adiposo e células do líquido amniótico para produção de embriões bovinos por transferência nuclear (clonagem)
title_fullStr Isolamento, criopreservação e utilização de células do cordão umbilical, células do tecido adiposo e células do líquido amniótico para produção de embriões bovinos por transferência nuclear (clonagem)
title_full_unstemmed Isolamento, criopreservação e utilização de células do cordão umbilical, células do tecido adiposo e células do líquido amniótico para produção de embriões bovinos por transferência nuclear (clonagem)
title_sort Isolamento, criopreservação e utilização de células do cordão umbilical, células do tecido adiposo e células do líquido amniótico para produção de embriões bovinos por transferência nuclear (clonagem)
author Silva, Carolina Gonzales da
author_facet Silva, Carolina Gonzales da
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Báo, Sônia Nair
dc.contributor.author.fl_str_mv Silva, Carolina Gonzales da
dc.subject.por.fl_str_mv Gado
Células-tronco
Cordão umbilical
topic Gado
Células-tronco
Cordão umbilical
description Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2013.
publishDate 2013
dc.date.none.fl_str_mv 2013-07-17T19:53:20Z
2013-07-17T19:53:20Z
2013-07-17
2013-02-21
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv SILVA, Carolina Gonzales da. Isolamento, criopreservação e utilização de células do cordão umbilical, células do tecido adiposo e células do líquido amniótico para produção de embriões bovinos por transferência nuclear (clonagem). 2013. xv, 83 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Animal)—Universidade de Brasília, Brasília, 2013.
http://repositorio.unb.br/handle/10482/13593
identifier_str_mv SILVA, Carolina Gonzales da. Isolamento, criopreservação e utilização de células do cordão umbilical, células do tecido adiposo e células do líquido amniótico para produção de embriões bovinos por transferência nuclear (clonagem). 2013. xv, 83 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Animal)—Universidade de Brasília, Brasília, 2013.
url http://repositorio.unb.br/handle/10482/13593
dc.language.iso.fl_str_mv por
language por
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Repositório Institucional da UnB
instname:Universidade de Brasília (UnB)
instacron:UNB
instname_str Universidade de Brasília (UnB)
instacron_str UNB
institution UNB
reponame_str Repositório Institucional da UnB
collection Repositório Institucional da UnB
repository.name.fl_str_mv Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)
repository.mail.fl_str_mv repositorio@unb.br
_version_ 1814508224620003328

Registros relacionados