Análise da seqüência das glicoproteínas de tospovírus com ocorrência no brasil e estudo da reação de resistência de Capsicum chinense a tomato spotted wilt virus

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Lovato, Fernanda Antinolfi
Data de Publicação: 2004
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/46270
Resumo: Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2023.
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spelling Análise da seqüência das glicoproteínas de tospovírus com ocorrência no brasil e estudo da reação de resistência de Capsicum chinense a tomato spotted wilt virusTospovírusCapsicum chinenseTese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2023.A espécie-tipo do gênero Tospovirus, o Tomato spotted wilt virus (TSWV), causa uma séria doença em centenas de espécies de plantas, sendo disseminada pelo mundo através do inseto vetor tripés. No Brasil, os tospovirus TSWV, Tomato chlorotic spot virus (TCSV) e Groundnut ringspot virus (GRSV) são responsáveis por elevados danos econômicos em importantes culturas, incluindo alface, amendoim, fumo, pimenta, pimentão e tomate. O genoma dos tospovirus é constituído por três segmentos de RNA fita simples (denominadosS, M e L RNA), codificando três proteínas estruturais (L, G1 e G2) e duas proteínas não-estruturais (NSm e NSs). As glicoproteínas G1 e G2 são projetadas a partir do envelope lipídico e possivelmente apresentam função importante durante a entrada do vírus nas células do vetor e, consequentemente, na transmissão viral. Esta tese descreve a análise do precursor das glicoproteínas e das regiões intergênica e 3’ terminal do M RNA do TCSV e do GRSV, baseando-se na determinação e comparação das seqüências dos aminoácidos e nucleotídeos dessas duas espécies com as de outros tospovirus. Os resultados das comparações indicaram que a seqüência de aminoácidos dos precursores das glicoproteínas do TCSV apresentou 81% de identidade com o TSWV, enquanto o GRSV apresentou 79% com o TSWV. Ao serem comparadas as seqüências de aminoácidos dos precursores do TCSV e GRSV entre si, a identidade aumentou para 92%, indicando que essas duas espécies mostraram alta similaridade e diferiram das demais espécies de tospovirus. Entretanto, o resultado da comparação das seqüências de nucleotídeos da região intergênica do M RNA do TCSV e GRSV mostrou ser de apenas 78% de identidade. As análises filogenéticas, baseadas nas seqüências do precursor das glicoproteínas e da região intergênica do M RNA, revelaram que TCSV e GRSV formaram um só agrupamento, próximo ao TSWV e distante das demais espécies de tospovirus. Os parâmetros taxonômicos relacionados à delimitação das espécies de tospovirus foram ainda discutidos. Na última década, foi relatada a reação de resistência tipo hipersensibilidade (HR) em acessos de Capsicum chinense ‘P1152225’ e ‘P1159236’ inoculados mecanicamente com TSWV. A segunda parte da tese descreve a identificação do provável gene de avirulência elicitor da reação de HR em C. chinense ‘P1159236’, conforme a teoria gene-a-gene de Flor (1942). Com este intuito, os genes das proteínas N (nucleoproteína), NSm (proteína de movimento) e NSs foram clonados individualmente no vetor binário pgR107 (pPVX), baseado no sistema de expressão Potato virus X (PVX). Os clones de Agrobacterium tumefaciens recombinantes transformados com as construções PVX+N, PVX+NSm, PVX+NSs, assim como o controle (A. Tumefaciens transformada com pPVX), foram inoculadas com palito em C. chinense ‘P1159236’, Datura stramonium e Nicotiana benthamiana. Os sintomas de PVX (clareamento de nervura, clorose internerval e mosqueado) apareceram na maioria das plantas inoculadas com as construções PVX+N, PVX+NSm e PVX+NSs. ELISA e “western blotting” foram realizados com as plantas sintomáticas e confirmaram a expressão das proteínas N, NSm e NSs. As plantas de C. chinense ‘P1159236’, Datura stramonium e Nicotiana benthamiana inoculadas com a contrução PVX+NSs mostraram expressão de sintomas necróticos sistêmicos severos, provavelmente causados pelo sinergismo do PVX com a proteína NSs-. As plantas inoculadas com a construção PVX+NSm mostraram sintomas idênticos à infecção ocasionada por pPVX, sugerindo que a proteína NSM não interferiu na expressão dos sintomas do PVX. Lesões cloróticas e necróticas tipo - HR acompanhadas por abscisão foliar foram observadas somente em C. chinense ‘P1159236’ inoculadas com a construção PVX+N, diferindo significativamente dos sintomas causados pelo pPVX e PVX selvagem. Esses resultados indicaram que o gene N provavelmente é o gene de avirulência elicitor da reação tipo - HR em C. chinense PI159236.The Tomato spotted wilt virus (TSWV) is the type-species of the genus Tospovírus. This species is spread worldwide and today causes a serious disease on hundreds of plant species. In Brazil, the tospoviruses TSWV, Tomato chlorotic spot virus (TCSV) and Groundnut ringspot virus (GRSV) are responsible for high economic losses in important crops as tomato, sweet pepper, pepper, lettuce, tobacco and peanut. The genome of tospoviruses is composed by three ssRNA (denoted S, M and L RNA), encoding three structural proteins (L, G1/G2 and N) and two non-structural proteins (NSM and NSs). The glycoproteins G1 and G2 are projected in the lipid envelope and most possibly play initial roles in virus entry in vector cells and consequent virus transmission. This thesis describes the analysis of the glycoprotein precursor and of the M RNA intergenic region (IGR) and 3’ terminal region of TCSV and GRSV. This analysis is based on the determination and comparison of amino acid and nucleotide sequences of these two species with other tospoviruses. TCSV glycoprotein amino acid sequence showed 81% identity with that of TSWV, while GRSV showed 79% with TSWV. When TCSV and GRSV was compared, the identity percentage was 92%, indicating that these two viruses showed high similarity between them and differed from other tospoviruses. However, the comparison of M RNA IGR nucleotide sequence between TCSV and GRSV showed 78%. Phylogenetic analysis, based on sequences of glycoprotein precursor and M RNA IGR, revealed that TCSV and GRSV were clustered, close to TSWV and distinct from other tospoviruses. Taxonomic parameters related to delimitation of tospovírus species were also discussed. In the past decade it was reported that reaction to TSWV mechanical inoculation in accessions of Capsicum chinense 'P1152225' and 'P1159236' resembled the hypersensitive-type response (HR). The second part of the thesis describes the attempts to identify the TSWV putative elicitor gene related to the HR-type reaction in C. chinense 'P1159236', according to gene-to-gene model of Flor (1942). For this purpose, the N (nucleoprotein), NSm (movement protein) and NSs genes of TSWV were cloned individually in frame into the 8 binary vector pgR107 (pPVX), based on Potato virus X (PVX) expression system. Recombinant Agrobacterium tumefaciens clones transformed with PVX+N, PVX+NSm and PVX+NSs constructs, as well as control (A. Tumefaciens transformed with pPVX), were tooth-pick inoculated into C. chinense PI159236'. Datura stramonium and Nicotiana benthamiana plants. Symptoms of PVX (vein clearing, interveinal chlorosis and mottling) appeared in the inoculated plants with the constructions PVX+N, PVX+NSm, PVX+NSs and pPVX. ELISA and western blotting were carried out with symptomatic plants and confirmed the N, NSM and NSs protein expression. C. chinense, D. stramonium and N. benthamiana inoculated with the construction PVX+NSs showed severe systemic necrotic symptoms expression, possibly caused by a synergism of PVX with NSs protein. These plants inoculated with PVX+NSm showed identical symptoms of PVX infection, suggesting that NSm protein did not interfere with PVX induced symptoms. HR-like chlorotic and necrotic lesions following leaf abscission were seen only in C. chinense 'P1159236' inoculated with the construct PVX+N gene, which differed significantly with symptoms caused by pPVX. This result indicated that the N gene is possibly the elicitor of the HR-like reaction in C. chinense 'PI159236'.Instituto de Ciências Biológicas (IB)Programa de Pós-Graduação em Biologia MolecularÁvila, Antônio Carlos deNagata, Alice Kazuko Inouefernanda.lovato@gmail.comLovato, Fernanda Antinolfi2023-08-10T21:00:31Z2023-08-10T21:00:31Z2023-08-102004info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfLOVATO, Fernanda Antinolfi. Análise da seqüência das glicoproteínas de tospovírus com ocorrência no brasil e estudo da reação de resistência de Capsicum chinense a tomato spotted wilt virus. 2023. 120 f., il. Tese (Doutorado em Biologia Molecular) — Universidade de Brasília, Brasília, 2023.http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/46270porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2023-12-13T14:47:17Zoai:repositorio.unb.br:10482/46270Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2023-12-13T14:47:17Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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