Produção, purificação e caracterização de L-asparaginase de Fusarium proliferatum DCFS10 em sistemas de tecnologia recombinante de Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris)

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Cardoso, Samuel Leite
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/50147
Resumo: Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2023.
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spelling Produção, purificação e caracterização de L-asparaginase de Fusarium proliferatum DCFS10 em sistemas de tecnologia recombinante de Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris)L-asparaginaseKomagataella phaffiiLeucemia linfoblástica aguda (LLA)Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2023.A L-asparaginase é o principal componente terapêutico no combate à leucemia linfoblástica aguda. Essa enzima catalisa a reação de hidrólise do aminoácido L-asparagina em amônia e ácido aspártico e, a partir de uma diferença metabólica crucial, é capaz de exaurir os níveis extracelulares do aminoácido tornando inviável o crescimento das células tumorais. Disponível no tratamento de leucemia linfoblástica aguda desde a década de 60, a L-asparaginase é produzida atualmente por meio de tecnologia recombinante em sistemas de expressão de proteínas heterólogas de Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi, o que impacta diretamente no tratamento e no aparecimento de diversos efeitos adversos. Deste modo, a produção de L-asparaginase de organismos eucariotos poderia ser uma estratégia para diminuir os eventos adversos e aumentar a eficácia terapêutica do medicamento. Sendo assim o presente trabalho teve como objetivo principal a produção, purificação, e análise da citotoxicidade da L-asparaginase recombinante frente a linhagem celular de células neoplásicas Jurkat (ATTC TIB-152). Optou-se pela produção de proteínas heterólogas por Komagataella phaffii (Pichia pastoris) com a integração de uma sequência codificante para L-asparaginase do fungo Fusarium proliferatum, proveniente da biodiversidade brasileira (Bioma Cerrado). Paralelamente, um estudo in silico da sequência proteica foi realizado para obtenção de maiores informações da estrutura tridimensional da enzima. O RNA total fúngico foi primeiramente extraído e convertido em cDNA. Após verificação na literatura e estudo das sequências de L-asparaginase presentes em bases de dados, foi possível construir os primers para amplificação e reconhecimento da sequência codificadora de L-asparaginase desejada. A sequência codificadora foi clonada em vetor comercial pPICZαA e células de E. coli foram transformadas. Posteriormente à clonagem em E. coli, os vetores foram transformados em células de Komagataella phaffii X-33 (Pichia pastoris X-33). Foram obtidos 21 transformantes, os quais foram testados quanto à produção de L-asparaginase, sendo que a maior atividade enzimática encontrada intracelularmente foi expressa no transformante 9 (2,84 UI/g). Visando um processo de purificação, a enzima foi extraída com a utilização de sonicador de ponteira e em seguida submetida à coluna de troca iônica DEAE FF 5 mL. Os resultados demonstram uma enzima parcialmente purificada que apresenta pH ótimo em torno de 7,0, temperatura ótima de 40 ºC e Km e Vmax nos valores de 17,44 mM e 5,35 mM/s-1 , respectivamente. A análise in silico pôde prever estruturas monoméricas com certo grau de confiabilidade, além disso apresentou resíduos de aminoácidos conservados em diferentes posições, confirmando a importância desses resíduos na atividade catalítica da enzima. Com relação aos ensaios de viabilidade celular, a L-asparaginase produzida neste trabalho demonstrou alta eficácia frente às células neoplásicas testadas em 24 horas de tratamento. Foi possível confirmar a integração da sequência codificadora de L-asparaginase de F. proliferatum no DNA genômico de K. phaffii X-33, a produção de uma enzima funcional parcialmente purificada, estável em pH próximo ao fisiológico, com atividade citotóxica frente a células de linhagem Jurkat, com amplo potencial para aplicação terapêutica. Como perspectiva, destaca-se a necessidade de avaliar e otimizar as condições de cultivo para uma produção industrial.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).L-asparaginase is the main therapeutic component against acute lymphoblastic leukemia. This enzyme catalyzes the hydrolysis of the amino acid L-asparagine into ammonia and aspartic acid and, based on a crucial metabolic difference, is capable of examining the extracellular levels of the amino acid, making the growth of tumor cells unviable. Available in the treatment of acute lymphoblastic leukemia since the 1960s, L-asparaginase is currently produced through recombinant technology in heterologous protein expression systems from Escherichia coli and Erwinia chrysanthemi, which directly impacts the treatment and the appearance of several adverse effects. Therefore, the production of Lasparaginase from eukaryotic organisms could be a strategy to reduce adverse events and increase the therapeutic efficacy of the drug. Therefore, the main objective of the present work was the production, purification, and analysis of the cytotoxicity of recombinant L-asparaginase against the Jurkat neoplastic cell line (ATTC TIB-152). We opted for the production of heterologous proteins by Komagataella phaffii (Pichia pastoris) with the integration of a coding sequence for L-asparaginase from the fungus Fusarium proliferatum, originating from Brazilian biodiversity (Cerrado Biome). At the same time, an in silico study of the protein sequence was carried out to obtain more information on the three-dimensional structure of the enzyme. Fungal total RNA was first extracted and converted into cDNA. After checking the literature and studying the L-asparaginase sequences present in databases, it was possible to construct primers for amplification and recognition of the desired L-asparaginase coding sequence. The coding sequence was cloned into commercial vector pPICZαA and E. coli cells were transformed. After cloning in E. coli, the vectors were transformed into Komagataella phaffii X-33 (Pichia pastoris X-33) cells. 21 transformants were obtained, which were tested for L-asparaginase production, with the highest enzymatic activity found intracellularly being expressed in transformant 9 (2.84 IU/g). Aiming for a purification process, the enzyme was extracted using a tip sonicator and then submitted to the DEAE FF 5 mL ion exchange column. The results demonstrate a partially purified enzyme that has an optimum pH of around 7.0, an optimum temperature of 40 ºC and Km and Vmax at values of 17.44 mM and 5.35 mM/s-1, respectively. The in silico analysis was able to predict monomeric structures with a certain degree of reliability, in addition to presenting conserved amino acid residues in different positions, confirming the importance of these residues in the catalytic activity of the enzyme. Regarding cell viability assays, the L-asparaginase produced in this work demonstrated high efficacy against neoplastic cells tested within 24 hours of treatment. It was possible to confirm the integration of the Lasparaginase coding sequence from F. proliferatum into the genomic DNA of K. phaffii X-33, the production of a partially purified functional enzyme, stable at pH close to physiological, with cytotoxic activity against Jurkat lineage, with broad potential for therapeutic application. As a perspective, the need to evaluate and optimize cultivation conditions for industrial production stands out.Faculdade de Ciências da Saúde (FS)Programa de Pós-Graduação em Ciências da SaúdeBatista, Pérola de Oliveira Magalhães DiasCardoso, Samuel Leite2024-08-23T18:21:12Z2024-08-23T18:21:12Z2024-08-232023-08-24info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfCARDOSO, Samuel Leite. Produção, purificação e caracterização de L-asparaginase de Fusarium proliferatum DCFS10 em sistemas de tecnologia recombinante de Komagataella phaffii (syn. Pichia pastoris). 2023. 104 f., il. Tese (Doutorado em Ciências da Saúde) — Universidade de Brasília, Brasília, 2023.http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/50147A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.unb.br, www.ibict.br, www.ndltd.org sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra supracitada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2024-08-23T18:21:12Zoai:repositorio.unb.br:10482/50147Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2024-08-23T18:21:12Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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