Expressão heteróloga da enzima L-asparaginase de Fusarium proliferatum em sistema de expressão Escherichia coli BL21(DE3)

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Rodrigues, Ana Luisa Leoncio
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/49579
Resumo: Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2023.
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spelling Expressão heteróloga da enzima L-asparaginase de Fusarium proliferatum em sistema de expressão Escherichia coli BL21(DE3)L-AsparaginaseFungosLeucemiaCâncer - tratamentoLeucemia linfoblástica aguda (LLA)Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2023.A L-asparaginase é uma enzima com propriedades de hidrólise da L-asparagina, um aminoácido essencial para células neoplásicas e não essencial para o organismo humano e síntese de células normais, já que o organismo humano possui capacidade de síntese desse aminoácido, sendo convertida em ácido aspártico e amônia. Essa enzima é amplamente utilizada no tratamento de doenças linfoproliferativas e linfomas, com destaque para a Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA), se tornando um dos principais agentes quimioterápicos dos últimos anos. A L-asparaginase atualmente aplicada nos esquemas terapêuticos são oriundas de microrganismos como Escherichia coli e Dickeya chrysanthemi, além da L-asparaginase PEGuilada que foi introduzida com o objetivo de diminuir a variedade de efeitos imunogênicos, neurotóxicos e de hipersensibilidade que os pacientes apresentam durante o tratamento oncológico, se tornando necessária a busca por novas fontes de produção da enzima. Portanto, esse trabalho avaliou a produção e atividade de L-asparaginase do fungo filamentoso do Cerrado brasileiro, Fusarium proliferatum, expressa em E. coli modificada pela deleção do gene nativo de L-asparaginase como hospedeira. A construção contendo o gene da L-asparaginase de F. proliferatum foi obtida utilizando o vetor de expressão pET-28a. A triagem de clones transformados resultou na seleção de um clone que foi utilizado ao longo de todo o trabalho, e a otimização de condições de cultivo revelou que a temperatura de 37 °C, utilizando uma concentração de 0.5 mM de IPTG foi a mais adequada para produção da enzima. A proteína foi extraída por metodologia de rompimento celular utilizando sonicador e analisada por eletroforese em gel de SDS-PAGE e Western blot. Os resultados evidenciaram o potencial para a expressão de uma proteína recombinante originária de um organismo eucarioto em um organismo procarioto, ressaltando a necessidade de otimização de processos e a importância dessas pesquisas no avanço do desenvolvimento de produtos biotecnológicos.Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF)L-asparaginase is an enzyme with hydrolytic properties targeting L-asparagine, an essential amino acid for neoplastic cells but non-essential for the human body and normal cell synthesis. The human body can synthesize this amino acid, converting it into aspartic acid and ammonia. Widely utilized in the treatment of lymphoproliferative diseases and lymphomas, notably Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL), L asparaginase has become one of the key chemotherapeutic agents in recent years. The L-asparaginase currently used in therapeutic regimens is derived from microorganisms such as Escherichia coli and Dickeya chrysanthemi. Additionally, PEGylated L-asparaginase has been introduced to reduce the variety of immunogenic, neurotoxic, and hypersensitivity effects observed in patients during oncological treatment, necessitating the search for new enzyme production sources. Hence, this study assessed the production and activity of L-asparaginase from the Brazilian Cerrado filamentous fungus, Fusarium proliferatum, expressed in E. coli modified through the deletion of the native L-asparaginase gene as the host. The construction containing the L-asparaginase gene from F. proliferatum was obtained using the expression vector pET-28a. Screening of transformed clones led to the selection of a clone used throughout the study, and optimization of cultivation conditions revealed that a temperature of 37 °C, with a concentration of 0.5 mM IPTG, was most suitable for enzyme production. Protein extraction employed cell disruption methodology using a sonicator and was analyzed through SDS-PAGE gel electrophoresis and Western blotting. Results highlighted the potential for expressing a recombinant protein originating from a eukaryotic organism in a prokaryotic organism, emphasizing the need for process optimization and the importance of such research in advancing the development of biotechnological products.Faculdade de Ciências da Saúde (FS)Departamento de Farmácia (FS FAR)Programa de Pós-Graduação em Ciências FarmacêuticasSouza, Paula Monteiro deRodrigues, Ana Luisa Leoncio2024-08-06T17:34:37Z2024-08-06T17:34:37Z2024-08-062023-12-07info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfRODRIGUES, Ana Luisa Leoncio. Expressão heteróloga da enzima L-asparaginase de Fusarium proliferatum em sistema de expressão Escherichia coli BL21(DE3). 2023. 97 f., il. Dissertação (Mestrado em Ciências Farmacêuticas) — Universidade de Brasília, Brasília, 2023.http://repositorio2.unb.br/jspui/handle/10482/49579porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2024-08-09T17:35:48Zoai:repositorio.unb.br:10482/49579Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2024-08-09T17:35:48Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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