Síntese química e caracterização das propriedades biológicas do peptídeo antimicrobiano Raniseptina-Bl 1 presente na secreção cutânea do anuro Boana lundii
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| Data de Publicação: | 2021 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | por |
| Título da fonte: | Repositório Institucional da UnB |
| Texto Completo: | https://repositorio.unb.br/handle/10482/43581 |
Resumo: | Dissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2021. |
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Síntese química e caracterização das propriedades biológicas do peptídeo antimicrobiano Raniseptina-Bl 1 presente na secreção cutânea do anuro Boana lundiiAnurosBoana lundiiPeptídeos antimicrobianosSíntese químicaDissertação (mestrado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2021.O uso indiscriminado de antibióticos tem contribuído para o aumento da prevalência de doenças patogênicas promovidas por microrganismos multirresistentes ao redor do mundo, o que representa um sério risco para a saúde humana. Diante desse quadro, a busca por novos agentes antimicrobianos tem mobilizado a comunidade científica. Os anuros possuem glândulas em sua pele que produzem e secretam uma grande variedade de compostos bioativos, dentre eles merecem destaque os peptídeos biologicamente ativos. Estas moléculas apresentam uma extensa gama de bioatividades, incluindo atividade antimicrobiana, imunomoduladora, antiviral e antitumoral. Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) ou peptídeos de defesa do hospedeiro (HDPs) surgem como uma alternativa para enfrentar as infecções por microrganismos multirresistentes. O presente estudo teve como objetivo geral a síntese química e a caracterização das propriedades biológicas do peptídeo antimicrobiano Raniseptina-Bl 1 identificado na secreção cutânea do anuro Boana lundii, espécie endêmica do Brasil. A Raniseptina-Bl 1 foi sintetizada manualmente com o emprego do método Fmoc/tBu. O peptídeo bruto foi purificado empregando-se RP-HPLC em uma coluna C18, resultando na obtenção do peptídeo sintético com alto grau de pureza o que foi confirmado por análise por espectrometria de massas do tipo MALDI-TOF observando-se a presença de um único componente com massa molecular protonada igual a 2724,2 Da, correspondendo ao peptídeo nativo isolado por Naywara Araújo, em 2018, a partir da secreção cutânea do anuro B. lundii. O peptídeo Raniseptina-Bl 1 representa o primeiro peptídeo da família das raniseptinas isolado da espécie B. lundii exibindo elevados índices de identidade e de similaridade com as Raniseptinas 3 e 13, previamente identificadas na pele do anuro Boana raniceps. A análise por dicroísmo circular, na presença de micelas de SDS, evidenciou que o peptídeo Raniseptina-Bl 1 assume uma conformação de estrutura secundária predominante em α-hélice, com helicidade de 82,7%. A raniseptina-Bl 1 sintética foi testada contra 4 bactérias e 2 espécies de fungos patogênicos. O peptídeo foi efetivo na inibição do crescimento das bactérias Gram-positivas com valores de MIC de 4 µM para Staphylococcus aureus e de 2 µM para S. epidermidis. No caso das bactérias Gram-negativas testadas, observou-se uma maior atividade da Raniseptina-Bl 1, com valores de 0,5 µM para Escherichia coli e de 1 µM para Klebsiella pneumoniae. O peptídeo também foi efetivo inibindo o crescimento das leveduras patogênicas Candida albicans apresentando valor de MIC de 8 µM e Cryptococcus neoformanscom MIC igual a 64 µM. Sua capacidade de lisar eritrócitos humanos também foi avaliada, exibindo uma taxa de hemólise moderada, menor que 40%, na maior concentração empregada (128 M). Já na região dos valores de MICs determinados para as bactérias testadas (0,5–4 M), a porcentagem de hemólise ficou abaixo de 10%, indicando uma baixa atividade citolítica. As alterações morfológicas sofridas pela bactéria Gram-negativa E. coli tratada com o peptídeo Raniseptina-Bl 1 foram avaliadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV). As bactérias tratadas nas diferentes concentrações (2, 4 e 8 µM) apresentaram rugosidades, irregularidades e deformidades na superfície celular. Também analisou-se os efeitos do peptídeo Raniseptina-Bl 1 na imunidade inata por meio da avaliação da influência na modulação da capacidade fagocítica e da produção de NETs por neutrófilos humanos. A incubação de neutrófilos com a Raniseptina-Bl 1, apesar de aparentemente influenciar o resultado, não teve validação estatística no caso da atividade fagocítica e da produção de NETs. Houve uma aparente interação entre a Raniseptina-Bl 1 e o fMLP na produção de NETs, no entanto não houve comprovação estatística pelo ANOVA de 2 vias do ponto central. Analisandose os parâmetros das retas, houve uma diferença significativa no coeficiente linear entre neutrófilos quiescentes e a combinação Raniseptina-Bl 1 e fMLP que sugere uma possível ação combinada, talvez sinérgica entre eles, de forma que juntos são possivelmente capazes de induzir formação de NETs. A Raniseptina-Bl 1 exibiu propriedades antimicrobianas promissoras, com valores de MIC na faixa de 0,5 a 8 M para os microrganismos testados, além de uma baixa atividade hemolítica (menos de 10% de hemólise na faixa detectada para os MICs). Esse conjunto de resultados sinaliza o potencial da Raniseptina-Bl 1 em servir como modelo para o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos de modo a superar a atual crise associada a resistência microbiana aos antibióticos comercialmente disponíveis.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).The indiscriminate use of antibiotics has contributed to the increase in the prevalence of pathogenic diseases promoted by multidrug-resistant microorganisms around the world, which represents a serious risk to human health. Given this situation, the search for new antimicrobial agents has mobilized the scientific community. Anurans have glands in their skin that produce and secrete a wide variety of bioactive compounds, including biologically active peptides. These molecules have an extensive range of bioactivities, such as antimicrobial, immunomodulatory, antiviral and antitumor activities. Antimicrobial peptides (AMPs) or host defense peptides (HDPs) have emerged as an alternative to face infections by multidrugresistant microorganims. The aim of the present work was to perform the chemical synthesis and characterization of the biological properties of the antimicrobial peptide Raniseptin-Bl 1 found in the cutaneous secretion of the anuran Boana lundii, an endemic species in Brazil. Raniseptin-Bl 1 was manually synthesized using the Fmoc/tBu method. The crude peptide was purified using RP-HPLC on a C18 column, resulting in the synthetic peptide with a high degree of purity, which was confirmed by MALDI-TOF mass spectrometry analysis, observing the presence of a single component with a protonated molecular mass equal to 2724.2 Da, corresponding to the native peptide isolated by Naywara Araújo, in 2018, from the cutaneous secretion of the anuran B. lundii. Raniseptin-Bl 1 represents the first peptide of the raniseptin family isolated from the species B. lundii exhibiting high identity and similarity indices with Raniseptins 3 and 13, previously identified in the skin of the anuran B. raniceps. Circular dichroism analysis, in the presence of SDS micelles, showed that Raniseptin-Bl 1 assumed a predominant secondary structure conformation in α-helix, with a helicity of 82.7%. The synthetic raniseptin-Bl 1 was tested against 4 bacteria and 2 species of pathogenic fungi. The peptide was effective in inhibiting the growth of Gram-positive bacteria with MIC values of 4 µM for Staphylococcus aureus and 2 µM for S. epidermidis. In the case of the Gram-negative bacteria tested, a higher activity of Raniseptin-Bl 1 was observed, with values of 0.5 µM for Escherichia coli and 1 µM for Klebsiella pneumoniae. The peptide was also effective in inhibiting the growth of pathogenic yeasts Candida albicans with a MIC value of 8 µM and Cryptococcus neoformans with a MIC equal to 64 µM. Its ability to lyse human erythrocytes was also evaluated, showing a moderate hemolysis rate, less than 40%, at the highest concentration used (128 M). In the region of the MICs values determined for the tested bacteria (0.5–4 M), the percentage of hemolysis was below 10%, indicating a low cytolytic activity. The morphological changes suffered by the Gram-negative bacteria E. coli treated with raniseptin-Bl 1 were evaluated by scanning electron microscopy (SEM). Bacteria treated at different concentrations (2, 4 and 8 µM) showed roughness, irregularities, and deformities on the cell surface. We also analyzed the effects of the peptide Raniseptin Bl 1 on innate immunity by evaluating its influence on the modulation of the phagocytic capacity and the production of NETs by human neutrophils. The incubation of neutrophils with Raniseptin-Bl 1, despite apparently influencing the result, did not have statistical validation in the case of phagocytic activity and NET production. There is an apparent interaction between Raniseptin-Bl 1 and fMLP in the production of NETs, however there was no statistical confirmation by 2-way ANOVA of the central point. Analyzing the straight line parameters, there is a significant difference in the linear coefficient between quiescent neutrophils and the combination of Raniseptin-Bl 1 and fMLP, which suggests a possible combined action, perhaps synergistic between them, in a way that together they are probably able to induce the formation of NETs. Raniseptin-Bl 1 exhibited promising antimicrobial properties, with MIC values ranging from 0.5 to 8 µM for the microorganisms tested, in addition to a low hemolytic activity (less than 10% hemolysis in the range detected for MICs). This set of results signals the potential of Raniseptin-Bl 1 to serve as a model for the development of new antimicrobial agents in order to overcome the current crisis associated with microbial resistance to commercially available antibiotics.Instituto de Ciências Biológicas (IB)Programa de Pós-Graduação em Biologia AnimalCastro, Mariana de SouzaSilva, Brunna de Oliveira2022-04-29T22:03:16Z2022-04-29T22:03:16Z2022-04-292021-12-28info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfSILVA, Brunna de Oliveira. Síntese química e caracterização das propriedades biológicas do peptídeo antimicrobiano Raniseptina-Bl 1 presente na secreção cutânea do anuro Boana lundii. 2021. [77] f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Animal) — Universidade de Brasília, Brasília, 2021.https://repositorio.unb.br/handle/10482/43581A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2024-01-31T17:17:08Zoai:repositorio.unb.br:10482/43581Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2024-01-31T17:17:08Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false |
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