Purificação e caracterização de peptídeos antimicrobianos isolados da secreção cutânea do anuro Boana lundii (Burmeister, 1856)

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Araújo, Naywara Oliveira de
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio.unb.br/handle/10482/35061
Resumo: Dissertação (mestrado)—Fundação Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2018.
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spelling Purificação e caracterização de peptídeos antimicrobianos isolados da secreção cutânea do anuro Boana lundii (Burmeister, 1856)Anuro - secreções cutâneasPeptídeos antimicrobianosDissertação (mestrado)—Fundação Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2018.O aumento da resistência de microrganismos patogênicos aos antibióticos disponíveis promoveu uma busca por novas alternativas terapêuticas para superar os mecanismos de resistência. Essa resistência é causada pelo uso indiscriminado de agentes antimicrobianos, pois podem favorecer linhagens de microrganismos resistentes. Os peptídeos antimicrobianos (PAMs) atuam com um mecanismo de ação diferenciado, podendo ser utilizado diretamente ou inspirar o desenho de novas drogas para que possam ser aplicadas como novas alternativas terapêuticas para combater a resistência antimicrobiana. O presente estudo teve como objetivo geral realizar a identificação, o isolamento e a caracterização química e biológica de peptídeos antimicrobianos inéditos presentes na secreção cutânea do anuro Boana lundii (Anura: Hylidae). Indivíduos adultos de B. lundii foram coletados no município de Monte Alegre de Goiás (GO) e a secreção cutânea foi obtida por estimulação elétrica moderada, liofilizada e armazenada a −20°C. Alíquotas da secreção seca foram fracionadas por RP-HPLC em coluna C18 column (Vydac 218TP54; 4,6 x 250 mm) usando gradiente linear de 0,1 % (v/v) TFA em acetonitrila, com fluxo de 1,0 mL/min. As frações eluidas foram monitoradas a 216 nm, coletadas manualmente e secas. Em seguida, foram realizados ensaios de varredura com as bactérias patogências Escherichia coli e Staphylococcus aureus para detecção das frações capazes de promover a inibição do crescimento microbiano. As frações com atividade inibitória sobre as bactérias utilizadas foram submetidas à análise por MALDI-TOF MS, permitindo a identificação de três peptídeos. Na fração 28 observou-se a presença de um componente principal de massa molecular igual a 2723,74 Da; na fração 29 detectou-se um componente com massa molecular igual a 1835,02 Da e na fração 30 outro peptídeo com massa molecular de 1879,05 Da. As estruturas primárias dos três peptídeos foram determinadas empregando-se degradação de Edman automatizada. O peptídeo oriundo da fração 28 (com cadeia polipeptídica de 27 resíduos de aminoácidos) foi denominado raniseptina-Bl 1 e exibiu similaridade com o peptídeo raniseptina 3 isolado da secreção do anuro B. raniceps. Tal peptídeo exibiu atividade antimicrobiana relevante sobre bactérias e fungos patogênicos, merecendo destaque seus efeitos sobre as bactérias S. epidermidis com CMI < 1 μM e sobre K. pneumoniae com valor de CMI = 2 μM. Também mostrou-se bem ativo sobre os fungos C. neoformans (CMI = 4 μM) e C. albicans (CMI = 16 μM). Outros dois peptídeos pertencentes à família das hilinas também foram isolados e caracterizados no presente trabalho. Tais peptídeos, denominados hilinas b3 e b4, mostraram-se mais ativos sobre as bactérias Gram-positivas do que sobre as Gram-negativas. A hilina b3 mostrou-se a mais ativa dentre as duas novas hilinas isoladas, merecendo destaque sua atividade sobre as bactérias Gram-positivas S. aureus e S. epidermidis com valores de CMI iguais a 8 μM e sobre o fungo C. neoformans com valor de CMI igual a 16 μM. Os três peptídeos exibiram atividade inibitória parcial sobre a proliferação do parasita T. cruzi, sendo que nenhum dos peptídeos testados conseguiu inibir completamente a proliferação do parasita mesmo na maior concentração empregada (128 μM). Os três peptídeos adotaram conformação em α-hélice na presença de micelas de SDS, ambiente que mimetiza a membrana plasmática de microrganismos. O presente estudo reforça o potencial terapêutico dos PAMs isolados da secreção cutânea de anuros e evidencia a necessidade de estudos sistemáticos visando explorar adequadamente o potencial farmacológico e bioquímico da anurofauna brasileira.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP-DF).Increased resistance of pathogenic microorganisms to the available antibiotics promoted a search for new therapeutic alternatives to overcome resistance mechanisms. The indiscriminate use of antimicrobial agents promotes this resistance, as they may select resistant microbial strains. Antimicrobial peptides (AMPs) act with a differentiated mechanism of action, and can be used directly or inspire the design of new drugs so that they can be applied as new therapeutic options to combat antimicrobial resistance. The general objective of this study was to perform the identification, purification and chemical and biological characterization of three novel antimicrobial peptides isolated from the skin secretion of Boana lundii (Anura: Hylidae). Adult specimens of B. lundii were collected in the municipality of Monte Alegre de Goiás (GO) and the cutaneous secretion was obtained by moderate electrical stimulation, lyophilized and stored at -20°C. Aliquots of the dry secretion were fractionated by RP-HPLC on C18 column (Vydac 218TP54; 4.6 x 250 mm) using a linear gradient of 0.1% (v / v) TFA in acetonitrile at a flow rate of 1.0 mL/min. The eluted fractions were monitored at 216 nm, manually collected and dried. Screening assays were then performed with pathogenic bacteria Escherichia coli and Staphylococcus aureus to detect the fractions capable of promoting inhibition of microbial growth. The fractions with inhibitory activity on the tested bacteria were analyzed by MALDI TOF MS, allowing the identification of three peptides. In fraction 28 it was observed the presence of a major component of molecular mass equals to 2,723.74 Da; in fraction 29 a component with a molecular mass of 1,835.02 Da and in fraction 30 another peptide with a molecular mass of 1,879.05 Da was detected. The primary structures of the three peptides were determined employing automated Edman degradation. The peptide from fraction 28 (with a polypeptide chain of 27 amino acid residues) was named raniseptin-Bl 1 and showed similarity to the peptide raniseptin 3 previously isolated from the secretion of the anuran B. raniceps. Such peptide exhibited relevant antimicrobial activity on pathogenic bacteria and fungi. Its effects on S. epidermidis bacteria with MIC <1 μM and on K. pneumoniae with MIC value = 2 μM deserved special mention. It was also very active on fungi C. neoformans (MIC = 4 μM) and C. albicans (MIC = 16 μM). Two other peptides belonging to the hylin family were also isolated and characterized in the present work. Such peptides, termed hylins b3 and b4, were more active on Gram-positive than on Gram-negative bacteria. Hylin b3 was the most active of the two new hylins isolated, emphasizing its activity on the Gram-positive bacteria S. aureus and S. epidermidis with MIC values equal to 8 μM and on the fungus C. neoformans with value of MIC equals to 16 μM. The three peptides exhibited partial inhibitory activity on T. cruzi parasite proliferation, and none of the peptides tested was able to completely inhibit the parasite proliferation even at the highest concentration (128 μM). The three peptides adopted -helix conformation in the presence of SDS micelles, an environment that mimics the plasma membrane of microorganisms. The present study reinforces the therapeutic potential of AMPs isolated from cutaneous secretion of anurans and evidences the need for systematic studies to properly explore the pharmacological and biochemical potential of Brazilian anurofauna.Instituto de Ciências Biológicas (IB)Programa de Pós-Graduação em Biologia AnimalCastro, Mariana de SouzaAraújo, Naywara Oliveira de2019-07-12T20:13:42Z2019-07-12T20:13:42Z2019-07-122018-08-16info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfARAÚJO, Naywara Oliveira de. Purificação e caracterização de peptídeos antimicrobianos isolados da secreção cutânea do anuro Boana lundii (Burmeister, 1856). 2018. xii, 44 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Animal)—Universidade de Brasília, Brasília, 2018.http://repositorio.unb.br/handle/10482/35061A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2024-01-31T17:17:07Zoai:repositorio.unb.br:10482/35061Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2024-01-31T17:17:07Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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