Caracterização biofísica de uma α2-macroglobulina bacteriana e avaliação do seu potencial uso na identificação de proteases

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Vidal, Julia Freitas Daltro
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio.unb.br/handle/10482/32297
Resumo: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018.
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spelling Caracterização biofísica de uma α2-macroglobulina bacteriana e avaliação do seu potencial uso na identificação de proteasesProteases - inibidorMacroglobulinasProteínasDissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018.As α2-macroglobulinas (A2M) são proteínas de alto peso molecular que atuam como inibidoras de amplo espectro de proteases. Essa inibição ocorre por meio de um mecanismo que envolve o aprisionamento físico da protease seguido pela formação de uma ligação covalente entre ambas as proteínas. A capacidade de captura das diversas classes de proteases poderia permitir sua utilização na identificação das mesmas em extratos celulares, podendo ser aplicada tanto na descoberta de novas proteases como na detecção de proteases alvo. Esse trabalho tem por objetivo caracterizar biofisicamente a α2-macroglobulina de Salmonella enterica e avaliar sua potencial utilização na identificação de proteases. A proteína foi expressa em E. coli BL21 (DE3) e purificada por cromatografia de afinidade a metal imobilizado (Ni2+), seguido por cromatografia de exclusão molecular. Foram realizados ensaios de dicroísmo circular a fim de verificar seu padrão de estrutura secundária em diferentes pH, bem como sua estabilidade térmica (25-95 ºC). Ensaios de fluorescência foram realizados com o intuito de analisar mudanças estruturais sofridas em uma ampla faixa de pH (3,5-9,0). Experimentos de ultracentrifugação analítica foram realizados a fim de compreender melhor a interação entre a A2M e a tripsina. Tanto a capacidade de ligar-se a proteases, como a habilidade em capturar proteases quando ligada em coluna foram testadas utilizando-se tripsina. Confirmadas tais capacidades, foram realizados testes com os extratos de Escherichia coli, Vigna unguiculata e Pichia pastoris a fim de detectar proteases ali presentes. As proteínas foram submetidas à proteólise e analisadas por espectrometria de massas. Houve mudanças no padrão de estrutura secundária quando a proteína foi submetida a pH ácidos e básicos (4,0 e 9,0) quando comparado ao pH próximo da neutralidade (7,5). Durante sua desnaturação térmica verificou-se que há agregação em temperaturas superiores a ~47ºC em todos os pH testados (4,0, 7,5 e 9,0), demostrando que a proteína não é estável termicamente. Foi observado que a proteína quando ligada à tripsina apresenta um padrão eletroforético e um perfil de eluição em gel filtração que indica a ocorrência de mudança conformacional. Entretanto, não foi obtido o mesmo resultado nos experimentos de ultracentrifugação analítica. A A2M aparenta formar dímeros, principalmente quando na presença da tripsina. Não houve a detecção de proteases nos testes com os extratos celulares testados. Contudo, tais testes devem ser aprimorados para um resultado mais confiável.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).α2-macroglobulins (A2M) are high molecular weight proteins that act as broad spectrum peptidase inhibitors. The inhibition occurs by a mechanism that involves the capture of the peptidase followed by the formation of a covalent bond between the two proteins. The capture of all the peptidases classes could allow its utilization in the identification of these proteins in cellular extracts, being possibly applied in the discovery of new peptidases and in the detection of target peptidases. The aim of this work was the biophysical characterization of the α2-macroglobulin from Salmonella enterica and evaluation of its potential use in the identification of proteases. The recombinant A2M protein was expressed in E. coli BL21 (DE3) and purified by immobilized metal ion affinity chromatography followed by size exclusion chromatography. Circular dichroism assays were performed in order to verify the A2M secondary structure in different pH conditions, as well as its thermal stability in a temperature range of 25-95 ºC. Fluorescence spectroscopy assays were performed to analyze structural changes in a wide range of pH (3.5-9.0). The ability of A2M to bind peptidases and its capacity to capture peptidases when immobilized to a column were tested using trypsin. Once these abilities were confirmed, tests were carried out with extracts of Escherichia coli, Vigna unguiculata and Pichia pastoris in order to identify its captured peptidases. Proteins were hydrolyzed and analyzed by mass spectrometry. Analytical ultracentrifugation experiments were performed in order to better understand the interaction between A2M and trypsin. There were changes in the secondary structure when the protein was subjected to acid and basic pH (4.0 and 9.0) when compared to neutral pH (7.5). During its thermal denaturation it was found that there is aggregation at temperatures above ~ 47 ° C in all tested pH conditions (4.0, 7.5 and 9.0), showing that the protein is not thermally stable. It was verified that the protein when bound to trypsin has an electrophoretic migration and a gel filtration elution profile that indicates the occurrence of conformational change. However, the same result was not observed with the analytical ultracentrifugation experiments. A2M seems to form dimers, especially in the presence of trypsin. There was no detection of peptidase in the tests with the cell extracts. However, such tests must be improved for a more reliable result.Barbosa, João Alexandre Ribeiro GonçalvesVidal, Julia Freitas Daltro2018-07-20T20:21:22Z2018-07-20T20:21:22Z2018-07-162018-02-28info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfVIDAL, Julia Freitas Daltro. Caracterização biofísica de uma α2-macroglobulina bacteriana e avaliação do seu potencial uso na identificação de proteases. 2018. 86 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2018.http://repositorio.unb.br/handle/10482/32297A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2023-07-13T20:52:13Zoai:repositorio.unb.br:10482/32297Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2023-07-13T20:52:13Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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