Caracterização do promotor do gene da piruvato descarboxilase (pdc) de Zymomonas mobilis

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Vieira, Vanessa Rodrigues
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: https://repositorio.unb.br/handle/10482/44932
Resumo: Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa em Rede Multi-Institucional do Pró-Centro-Oeste de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade, 2022.
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spelling Caracterização do promotor do gene da piruvato descarboxilase (pdc) de Zymomonas mobilisZymomonas mobilisPromotor de genePiruvato descarboxilaseTese (doutorado)—Universidade de Brasília, Programa em Rede Multi-Institucional do Pró-Centro-Oeste de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biodiversidade, 2022.A bactéria Zymomonas mobilis é um microrganismo que se tornou comercialmente interessante, devido às suas características fermentativas e metabólicas, principalmente para as indústrias energética e química. Esse microrganismo pode ser geneticamente manipulado e com isso é possível obter maiores titulações de bioprodutos, porém não existem muitas ferramentas genéticas desenvolvidas para que esta bactéria seja manipulada com eficiência. Esse estudo teve como objetivo caracterizar o promotor do gene (pdc) da piruvato descarboxilase de Z. mobilis responsável por codificar a proteína Pdc, enzima chave na produção de etanol por esta bactéria. Foram construídos vetores utilizando como base o plasmídeo pB1PDC, contendo o promotor pdc de 500 pb controlando a expressão do gene codificador da proteína verde fluorescente, eGFP. A partir deste plasmídeo foram gerados fragmentos menores do promotor pdc. Z. mobilis ZM4 foi transformada com as construções contendo os diferentes fragmentos do Ppdc e analisada por citometria de fluxo para detectar a fluorescência de eGFP e com isso, verificar a força do promotor. Foram obtidos dois grupos diferentes quanto a intensidade da fluorescência de eGFP, o primeiro grupo com os fragmentos Ppdc146 pb e Ppdc197pb com intensidade menor de fluorescência de eGFP, enquanto o segundo grupo com os fragmentos Ppdc305, Ppdc405 e Ppdc505 com maior intensidade de fluorescência que o primeiro grupo. Estes resultados indicaram que o elemento de ligação da subunidade σ 70 sigma 70 está contido dentro do fragmento de 146 pb, pois mesmo com o menor fragmento do promotor obteve-se fluorescência. Também foi observada a presença de uma região regulatória entre as regiões -197 e -305 do promotor, que apresentou uma diferença significativa entre os índices de fluorescência. Como estratégia para identificar o elemento de ligação no promotor da subunidade sigma foram construídos oligonucleotídeos mutantes para as prováveis regiões -10 e -35 do promotor Ppdc146 pb. As sequências mutadas e não mutadas das regiões -10 e -35 foram inseridas no plasmídeo pB1PDC com Ppdc146, e foram testadas quanto a expressão da fluorescência de eGFP por citometria de fluxo. A mutação na região -10 do promotor pdc manteve atividade de eGFP, no entanto, quando a região -35 foi mutada, não houve atividade de eGFP. Portanto, a região – 35 do promotor pdc é a região mais importante, onde provavelmente ocorre a ligação da subunidade sigma 70 ao promotor, dando início ao processo de transcrição. No entanto, não foi possível definir o elemento de ligação da subunidade sigma 70 no promotor.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).The bacterium Zymomonas mobilis is a microorganism that has become commercially interesting due to its fermentative and metabolic characteristics, mainly for the energy and chemical industries. This microorganism can be genetically manipulated and it is possible to obtain higher titers of bioproducts, but there are not many genetic tools developed for this bacterium to be manipulated efficiently. The aim of this study was to characterize the promoter of the pyruvate decarboxylase (pdc) gene from Z. mobilis responsible for encoding the protein pyruvate decarboxylase, a key enzyme in the production of ethanol by this bacterium. Expression vectors were constructed using the pBBR1MCS1 plasmid as a base, containing the 500 bp pdc promoter controlling the eGFP fluorescent protein. From this plasmid, others were constructed with smaller fragments of the pdc promoter. Z. mobilis ZM4 was transformed with the constructs containing the different fragments of Ppdc and analyzed by flow cytometry to detect the fluorescence of eGFP and with that, to verify the strength of the promoter. Two different groups were obtained in terms of eGFP fluorescence intensity, the first group with Ppdc146 pb and Ppdc197pb fragments with lower eGFP fluorescence intensity, while the second group with Ppdc305, Ppdc405 and Ppdc505 fragments with greater fluorescence intensity than the first group. This suggests that the sigma 70 subunit binding element is contained within the 146 bp fragment, because it was possible to observe fluorescence with the smallest fragment. A regulatory region was also observed entre as regiões -197 e -305, where there was a significant difference between the fluorescence indices. As a strategy to identify the Sigma 70 binding element within the promoter, -10 and -35 mutated oligonucleotides of the Ppdc146 bp promoter were constructed. The mutated and unmutated sequences from the -10 and -35 regions were inserted into the plasmid PBR1Mpdc146, and were tested for eGFP fluorescence expression in flow cytometry. The -10 region mutation of the pdc promoter maintained eGFP activity, however, when the - 35 region was mutated, there was no eGFP activity. Therefore, the -35 region of the pdc promoter is the most important region, where the sigma 70 subunit binds to the promoter, initiating the transcription process. However, it was not possible to define the exact sequen.Moraes, Lídia Maria Pepe deVieira, Vanessa Rodrigues2022-09-28T22:10:16Z2022-09-28T22:10:16Z2022-09-282022-06-15info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfVIEIRA, Vanessa Rodrigues. Caracterização do promotor do gene da piruvato descarboxilase (pdc) de Zymomonas mobilis. 2022. 84 f., il. Tese (Doutorado em Biotecnologia e Biodiversidade)—Universidade de Brasília, Brasília, Brasília, 2022.https://repositorio.unb.br/handle/10482/44932info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2023-07-25T02:23:51Zoai:repositorio.unb.br:10482/44932Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2023-07-25T02:23:51Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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