Desenvolvimento de processos para produção em escala da enzima L - Asparaginase Por Escherichia coli BL21 (DE3) AspB

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Barros, Thaís de Sousa
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: https://repositorio.unb.br/handle/10482/39745
Resumo: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2020.
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spelling Desenvolvimento de processos para produção em escala da enzima L - Asparaginase Por Escherichia coli BL21 (DE3) AspBL-AsparaginaseEscherichia coliLactoseBiorreatorDissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2020.A enzima L-asparaginase (L-ASNase) catalisa a hidrólise do aminoácido asparagina em ácido aspártico e amônio. Devido ao seu mecanismo de ação, esta enzima é utiliza no tratamento da leucemia linfocítica aguda, pois quando a L-ASNase é administrada no plasma sanguíneo causa o esgotamento do aminoácido resultando na apoptose seletiva das células cancerígenas. A enzima L-asparaginase não é produzida no Brasil, devido ao desabastecimento ocorrido em 2013 no mercado brasileiro desta enzima viu-se a necessidade de uma produção nacional da L-ASNase. Buscando alternativas viáveis de produção desta enzima, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de processos para a produção em escala da enzima L-ASNase pela bactéria Escherichia coli BL21 (DE3) AspB. Para a quantificação da enzima L-ASNase foram comparados os métodos de Nessler e o método de β-hidroxamato aspártico (AHA), sendo escolhido o AHA devido sua baixa interferência com a amônia livre. Foram testados três meios de cultivo, o meio definido, o meio semi-definido e o meio complexo. O meio definido foi o que obteve menor custo de produção e a maior atividade de L-ASNase. Para a fase de produção da enzima, dois indutores foram comparados, a lactose e seu análogo IPTG. Das concentrações testadas para os indutores as que obtiveram a maior atividade da enzima foi de 10 g L-1 para a lactose e 0,45 mmol L-1 para o IPTG. O momento da curva de crescimento que obteve a maior atividade da L-ASNase para o início da indução foi no meio da fase exponencial. A atividade da L-ASNase foi acompanhada durante o intervalo de 10-24h, nos tempos 18 e 20h não houve diferença estatísticas entre os indutores. A lactose foi escolhida como indutor para a continuidade dos experimentos devido a semelhança entre as atividades da L-ASNase com ambos os indutores, baixa toxicidade e baixo custo. Nos estudos em biorreator, foram feitos cultivos em batelada e batelada alimentada tendo como objetivo a alta densidade celular para depois iniciar a indução do cultivo. Os cultivos de batelada alimentada o peso seco final foi de 69,90 g L-1 . A produção da enzima L-ASNase em batelada alimentada induzida com 30 g L-1 a que apresentou a melhor produção da enzima com 43.954,79 U L-1. A produção da enzima L-ASNase foi realizada com sucesso em agitador orbital e biorreator, trazendo avanços para a produção de uma enzima L-ASNase nacional que seja viável economicamente.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).The enzyme L-asparaginase (L-ASNase) catalyzes the hydrolysis of the amino acid asparagine in aspartic acid and ammonium, due to its mechanism of action this enzyme is used in the treatment of acute lymphocytic leukemia, because when L-ASNase is administered in the blood plasma it causes the depletion of the amino acid resulting in the selective apoptosis of cancer cells. There are commercial L-ASNases, but none produced in Brazil, due to the shortage in 2013 in the Brazilian market of this enzyme, there was a need for a national production of LASNase. Searching for viable alternatives for the production of this enzyme, the objective the development of processes for the scale production of the L-ASNase enzyme by Escherichia coli BL21 (DE3) AspB. For the quantification of the enzyme L-ASNase, the methods of Nessler and the method of β-hydroxamate aspartic (AHA) were compared due to its low interference with free ammonia. Three culture media were tested, the defined medium, the semi-defined medium and the complex medium. The defined medium the lowest production cost and the highest LASNase activity. Two inducers were compared, lactose and its IPTG analogue. Of the concentrations tested for inductors, those that obtained the highest enzyme activity were 10 g L1 for lactose and 0.45 mmol L-1 for IPTG. The time of the growth curve that obtained the highest L-ASNase activity for the beginning of the induction was in the middle of the exponential phase. The activity of L-ASNase was monitored during the interval of 10-24h, at times 18 and 20h there was no statistical difference between the inductors. Lactose was chosen as an inducer for the continuity of the experiments due to the similarity between the activities of L-ASNase with both inductors, low toxicity and low cost. In the bioreactor studies, batch and fed batch cultures were carried out with the objective of high cell density and then start the culture induction. The fed batch cultures were carried out, the final dry weight was 69.90 g L-1 . The enzyme L-ASNase in batch fed induced with 30 g L-1 presented the best enzyme production with 43,954.79 U L-1 . The production of the enzyme L-ASNase was successfully carried out in a shaker and bioreactor, bringing advances to the production of a national L-ASNase enzyme that is economically viable.Faculdade de Ciências da Saúde (FS)Programa de Pós-Graduação em Ciências da SaúdeBatista, Pérola de Oliveira Magalhães DiasParachin, Nádia Skorupathaisousabarros@hotmail.comBarros, Thaís de Sousa2020-12-17T16:20:12Z2020-12-17T16:20:12Z2020-12-172020-08-11info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfBARROS, Thaís de Sousa. Desenvolvimento de processos para produção em escala da enzima L - Asparaginase Por Escherichia coli BL21 (DE3) AspB. 2020. 83 f., il. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde)—Universidade de Brasília, Brasília, 2020.https://repositorio.unb.br/handle/10482/39745A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2024-02-27T20:18:39Zoai:repositorio.unb.br:10482/39745Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2024-02-27T20:18:39Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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