Estudos estruturais dos domínios c-terminais das septinas humanas 6, 7, 11 e 14

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Conceição, Wallace Vasconcelos de Oliveira
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: https://repositorio.unb.br/handle/10482/39338
Resumo: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2020.
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spelling Estudos estruturais dos domínios c-terminais das septinas humanas 6, 7, 11 e 14SeptinasFilamentosCoiled coilCristalizaçãoDissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2020.Septinas são proteínas originalmente descritas em leveduras, e também presentes em humanos e outros eucariotos. Essas proteínas formam filamentos e integram o citoesqueleto, onde desempenham importante papel no estágio final da divisão celular – citocinese. Estudos apontam seu envolvimento em patologias como mal de Parkinson, Alzheimer, leucemia e outras. Cada septina humana é formada por um domínio GTP central flanqueado pelos domínios N-terminal e C-terminal. Alguns domínios C-terminais de septinas contêm regiões descritas como coiled coil que se associam com alta afinidade, no entanto o papel destas na automontagem de filamentos de septinas não está definido e nenhuma estrutura cristalográfica destas está depositada nos bancos de dados. Neste trabalho, construções contendo regiões preditas como coiled coil dos domínios C-terminais das septinas humanas 6, 7, 11 e 14 foram expressas de forma heteróloga, purificadas e submetidas a ensaios biofísicos e de cristalização, tanto separadamente quanto combinadas. Os dados de estrutura secundária obtidas por dicroísmo circular mostram que, enquanto SEPT7c adota conformações helicoidais em pH 4, 7 e 9, apenas em pH 4 as construções de SEPT11c e SEPT14c apresentam α-hélices estáveis – indicando a presença de coiled coils nestas condições, ao considerar a razão [θ]MRE 222 nm/[θ]MRE 208 nm. As análises de SEC-MALS indicaram a presença de monômeros para as proteínas analisadas individualmente, enquanto que por crosslinking químico foi possível identificar a presença de homodímeros. Além disto, as duas técnicas demonstraram a presença de heterodímeros SEPT7c+SEPT11c. Os ensaios de ultracentrifugação analítica indicaram a influência do pH para a conversão de SEPT7c de monômeros para dímeros, porém o mesmo não foi observado para as demais construções nas condições testadas. Centenas de condições de cristalização foram triadas roboticamente, assim como a variação de temperatura para favorecer a precipitação organizada das proteínas. Alguns cristais foram identificados e o espaço químico em torno das condições observadas foi explorado. Os cristais foram submetidos a ensaios de difração de raios X em difratômetro in house (D8 Venture) e também na fonte de luz Síncrotron do LNLS, contudo apenas conjuntos de dados de baixa resolução foram obtidos não permitindo a resolução das estruturas destas proteínas.Fundação de Amparo à Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).Septins were first identified and described in yeast and nowadays is known their presence in human and other eukaryotes. These proteins form filaments and include the cytoskeleton compounds, in which play an important role in the final stage of cell division – cytokinesis. Many evidences support the participation of septins in pathological conditions like leukemia, Parkinson's and Alzheimer's disease, and others. Each human septin present a central guanine nucleotide binding domain that is flanked by N-terminal and C-terminal domains. Some septins present in its C-terminal domain regions predicted to form coiled coil structures and the function of these structures to form filaments still not clear and no crystallographic structure of those is deposited on data banks. In this work, constructions of C-terminal domains of human septins 6, 7, 11 and 14 were heterologously expressed and purified. Subsequently, biophysical and crystallization assays were done using individually or combined septins samples. The secondary structure data obtained by circular dichroism indicated that SEPT7c adopts helicoidal conformation at pH 4, 7 and 9. Otherwise, the data showed that SEPT11c and SEPT14c assume α-helix structure only at pH 4, suggesting the presence of coiled coils when considering the ratio [θ]MRE 222 nm/[θ]MRE 208 nm in these conditions. SEC-MALS analyses showed the monomeric state of each protein, whereas homodimeric architectures were obtained by chemical crosslinking. Besides that, the SEPT7c+SEPT11c heterodimers formation was observed by both techniques. Analytical ultracentrifugation demonstrated that pH participates in the formation of SEPT7c dimers, but the same was not observed for the other septins. Hundreds of conditions were automated explored as also the variation of temperature to favour the proteins crystallization. Some conditions yielded crystals and the chemical space around these conditions were explored. The crystals were subject to X-ray diffraction using an in house D8 Venture diffractometer and in the Synchrotron light source of LNLS, however only low resolution datasets were obtained not allowing the resolution of these protein structures.Instituto de Ciências Biológicas (IB)Departamento de Biologia Celular (IB CEL)Programa de Pós-Graduação em Biologia MicrobianaValadares, Napoleão FonsecaConceição, Wallace Vasconcelos de Oliveira2020-07-31T00:11:50Z2020-07-31T00:11:50Z2020-07-302020-03-17info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfCONCEIÇÃO, Wallace Vasconcelos de Oliveira. Estudos estruturais dos domínios c-terminais das septinas humanas 6, 7, 11 e 14. 2020. 97 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Microbiana)—Universidade de Brasília, Brasília, 2020.https://repositorio.unb.br/handle/10482/39338A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2024-02-08T18:15:15Zoai:repositorio.unb.br:10482/39338Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2024-02-08T18:15:15Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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