A família de fragmentos gênicos variáveis VH10 apresenta características determinantes para a geração de anticorpos anti-DNA

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Araujo, Ronny Petterson dos Santos
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: https://repositorio.unb.br/handle/10482/42514
Resumo: Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2021.
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spelling A família de fragmentos gênicos variáveis VH10 apresenta características determinantes para a geração de anticorpos anti-DNAAnti-DNAAutorreativoVH10CDR2scpre-BCRTese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2021.Anticorpos anti-DNA são um dos principais alvos para estudos de algumas doenças autoimunes uma vez que são encontradas no soro de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (LES) e influenciam o aparecimento de sintomas e na progressão da doença. Apesar da importância acerca desses anticorpos sua origem e manutenção no organismo não são completamente compreendidas. A presença de linfócitos B com repertórios autorreativos no organismo pode favorecer o aparecimento de anticorpos patogênicos que interagem com estruturas próprias do organismo. Mostramos anteriormente que uma família específica de segmentos gênicos variáveis, VH10, tem a tendência a dar origem a anticorpos com capacidade de ligação ao DNA. Nesse estudo procuramos mostrar o papel dessa família VH na ligação específica ao DNA. No intuito de se investigar quais as regiões determinantes para a ligação de anticorpos formados por segmentos V provenientes da família VH10 ao DNA, foram produzidos quatro fragmentos de anticorpos no formato scFv (fragmento variável de cadeia única). As sequências germinais foram mantidas para duas construções: VH10 (descrito como ligante) e VH4 (não-ligante) foi utilizada como controle. Nas outras duas construções a região do loop da CDR2 foi trocada entre VH10 e VH4 formando as construções variantes VH10-H24 e VH4-H210. A parte remanescente da construção, CDR3 e cadeia leve, é compartilhada entre os scFvs. A cadeia leve utilizada é uma recombinante da cadeia leve substituta (SLC) característica de células B em desenvolvimento e expressa apenas temporariamente na medula óssea (MO). Como essas novas moléculas apresentam características únicas para estudos de ligação antigênica no contexto de desenvolvimento das células B, foram nomeadas de scpre-BCRs. A capacidade de ligação dos scpre-BCRs foi acessada por ELISA. O scpre- BCR VH10 apresentou capacidade de ligação a diferentes tipos de DNA, já o scpre-BCR VH4 não apresentou atividade de ligação. A variante VH10-H24 onde o loop da CDR2 foi trocado apresentou perda da atividade de ligação, enquanto a variante VH4-H210 apresentou ganho na capacidade de ligação contra os antígenos de ssDNA e dsDNA. A modelagem dos sítios de ligação do scpre-BCR VH10 sugere que um arcabouço positivamente carregado formado pelos resíduos da CDR2 é elemento estrutural responsável pela ligação. Neste trabalho nós mostramos que a reatividade contra o DNA pode estar codificada no genoma dos indivíduos haja vista o mapeamento do sítio fundamental para a ligação ao DNA localizada no loop estrutural da CDR2, parte integrante do gene V. Isso sugere um papel para essa reatividade germinal nas fases inicias do desenvolvimento das células B. Dessa forma, enquanto que a autorreatividade ao DNA possa levar a autoimunidade, parece existir um trade-off onde a necessidade de sinalização celular nos estágios iniciais das células B age em conjunto à mecanismos autorreativos.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).Anti-DNA antibodies are one of the main targets for autoimmune disease studies as they are found in the serum of patients with systemic lupus erythematosus (SLE) and directs the appearance of symptoms and disease progression. Despite its importance the origin and maintenance of these antibodies are not fully understood. The presence of B lymphocytes with autoreactive repertoires in the organism may favor the surge of pathogenic antibodies that interacts with organism's structures. Through a database survey, our group discovered a family of the V gene segment that is part of the antibody variable region, VH10, which is capable of giving rise to antibodies with the ability to bind to DNA. Further studies showed that antibodies formed by VH10 family V genes had some independence from CDR3 for establishing DNA affinity. In order to investigate which regions determine the biding of antibodies formed by V segments from the VH10 family to DNA, four antibody fragments in scFv format (single-chain variable fragment) were produced. germline sequences were maintained for two constructs: VH10 (described as binder) and VH4 (non-binder) was used as control. In the other two constructs the CDR2 loop region was swapped between VH10 and VH4 forming the variant constructs VH10-H24 and VH4-H210. The remaining part of the construct, CDR3 and light chain, is shared between scFvs. The light chain used is a recombinant surrogate light chain (SLC) characteristic of developing B cells and expressed only temporarily in bone marrow (MO). As these new molecules have unique characteristics for antigen binding studies in the context of B cell development, they were named scpre-BCRs. The binding capacity of scpre-BCRs was accessed by ELISA. The scpre-BCR VH10 showed binding capacity to different types of DNA, while the scpre-BCR VH4 did not show binding activity. The VH10-H24 variant where the CDR2 loop was exchanged showed loss of binding activity, while the VH4-H210 variant appears to recover its binding activity against ssDNA and dsDNA antigens. The modeling of scpre-BCR VH10 binding sites suggests that a positively charged scaffold formed by CDR2 residues is the structural element responsible for binding. In this work, we show that reactivity against DNA may be encoded in the genome of individuals in view of the mapping of the crucial site for DNA binding located in the structural loop of CDR2, an integral part of V gene. This suggests a role for this germinal reactivity in early stages of B cell development. Thus, while DNA autoreactivity can lead to autoimmunity, there appears to be a trade-off where the need for cell signaling in the early stages of B cells acts together with autoreactive mechanismsBrígido, Marcelo de MacedoAraujo, Ronny Petterson dos Santos2021-12-01T17:19:10Z2021-12-01T17:19:10Z2021-11-012021-09-03info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdfARAUJO, Ronny Petterson dos Santos. A família de fragmentos gênicos variáveis VH10 apresenta características determinantes para a geração de anticorpos anti-DNA. 2021. 68 f., il. Tese (Doutorado em Biologia Molecular) — Universidade de Brasília, Brasília, 2021.https://repositorio.unb.br/handle/10482/42514A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições:Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNB2023-07-08T00:00:58Zoai:repositorio.unb.br:10482/42514Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2023-07-08T00:00:58Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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