Mecanismo estrutural de regulação alostérica por potássio da enzima adenosina quinase : Structural mechanism of allosteric regulation by potassium of the enzyme adenosine kinase

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Oliveira, Renata Rocha, 1980-
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1637810
Resumo: Orientador: Kleber Gomes Franchini
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spelling Mecanismo estrutural de regulação alostérica por potássio da enzima adenosina quinase : Structural mechanism of allosteric regulation by potassium of the enzyme adenosine kinaseStructural mechanism of allosteric regulation by potassium of the enzyme adenosine kinaseAdenosina quinaseRegulação alostéricaPotássioAdenosine kinaseAllosteric regulationPotassiumOrientador: Kleber Gomes FranchiniTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: A adenosina quinase (ADK -EC 2.7.1.20) é uma fosfotransferase responsável pela transferência catalítica do 'gama'-fosfato do ATP para adenosina (ADO). Essa reação desempenha um papel fundamental na regulação de níveis celulares de adenosina e, desta forma, interfere em diversos mecanismos homeostáticos e fisiopatológicos (e.g. inflamação, isquemia, etc). A reação catalítica da ADK, envolve regulação complexa pelos substratos e produtos, bem como por Mg2+ e fosfato inorgânico. Apresentamos neste trabalho, duas novas estruturas cristalinas da ADK murina, sendo um complexo binário na presença do substrato ADO (mADK:ADO) e um complexo ternário na presença de ambos ADO e ADP (mADK:ADO:ADP). No complexo ternário, além dos substratos, identificamos íons regulatórios essenciais para sua atividade catalítica, e de forma inédita, um íon K+ foi encontrado ligado entre regiões de alças adjacentes ao sítio de interação com o ATP. Neste sítio, o K+ liga-se de forma hexacoordenada às cadeias principal e lateral do Asp310 e a cadeia principal da Asn312, aminoácidos integrantes de um motivo que compõe um anion hole em quinases. Sua hexacoordenação completa-se através da interação com cadeias laterais da Ile330, Arg333 e Gly335 a partir da alça de extensão C-terminal da enzima. Ensaios de ressonância magnética nuclear 2D 15N-1H HSQC revelaram que a ligação de K+ perturba o Asp310 e resíduos das hélices adjacentes ('alfa'11 e 'alfa'13), envolvendo uma transição para uma estrutura cataliticamente produtiva. Consistente com os dados estruturais, mutantes D310P e D310A mostraram-se cataliticamente deficientes, com perda da capacidade de resposta ao K+. Espectros de Diferença de Transferência de Saturação (STD) em experimentos de titulação de ATP'gama'S, forneceram evidências para a redução da afinidade do mutante D310P da mADK pelo ATP'gama'S. Além disso, demonstramos que aumento na concentração de K+ modula a atividade in vitro da mADK (aumento de 2,5 vezes; Kd aparente = 10,4 mM). Mecanisticamente, o K+ aumenta a eficiência catalítica (Kcat), mas não afeta a afinidade da mADK para os substratos ADO e ATP. A depleção intracelular inibe, enquanto o restabelecimento da concentração intracelular do K+ recupera completamente a atividade celular de ADK. De maneira geral, nossos resultados contribuem para o entendimento da cinética da ADK e estabelecem base estrutural para a ativação alostérica da ADK por K+. Ainda, os resultados de experimentos funcionais em células apontam para o papel central da ADK como componente de um sistema de regulação do metabolismo de purina por variações da concentração intracelular de K+Abstract: Adenosine kinase (ADK -EC 2.7.1.20) is a phosphotransferase responsible for the catalytic transfer of 'gama'-phosphate from ATP to adenosine (ADO). This reaction plays a key role in regulating cellular adenosine levels and thus interferes with various homeostatic and pathophysiological mechanisms (e.g. inflammation, ischemia, etc.). The catalytic reaction of ADK involves complex regulation by substrates and products, as well as by Mg2+ and inorganic phosphate. In this work, we report two new crystal structures of murine ADK, one binary complex in the presence of ADO (mADK: ADO) and one ternary complex in the presence of both ADO and ADP (mADK: ADO: ADP). In the ternary complex, besides the substrates, we identified essential regulatory ions for its catalytic activity, and for the first time, a K+ ion was found bound between loop regions adjacent to the ATP interaction site. At this site, K+ binds hexacoordinately in the main and side chains of the Asp310 and the Asn312 main chain, amino acids that form an anion hole in kinases. Its hexacoordination is complete through interaction with side chains of Ile330, Arg333 and Gly335 from the enzyme C-terminal extension loop. 2D 15N-1H HSQC nuclear magnetic resonance assays revealed that K+ binding disturbs Asp310 and adjacent helix residues ('alpha'11 and 'alpha'13), involving a transition to a catalytically productive structure. Consistent with the structural data, D310P and D310A mutants were catalytically deficient, with loss of K+ responsiveness. Saturation Transfer Difference (STD) spectra in ATP'gama'S titration experiments provided evidence for the reduction of D310P mutant affinity for ATP'gama'S. In addition, we demonstrated that an increase in K+ concentration modulates in vitro mADK activity (2.5-fold increase; apparent Kd = 10.4 mM). Mechanistically, K+ increases catalytic efficiency (Kcat), but does not affect mADK affinity for ADO and ATP substrates. Intracellular depletion inhibits, while reestablishing of the intracellular K+ completely recovers ADK cell activity. Overall, our results contribute to the understanding of ADK kinetics and establish a structural basis for allosteric activation of ADK by K+. Furthermore, the results of functional cell experiments suggest the central role of ADK as a component of a purine metabolism regulation system by intracellular K+ concentration variationsDoutoradoFisiopatologia MédicaDoutora em Ciências[s.n.]Franchini, Kleber Gomes, 1961-Cardoso, Alisson CamposOliveira, Juliana Ferreira deCarneiro, Everardo MagalhãesGonçalves, Danieli CristinaUniversidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências MédicasPrograma de Pós-Graduação em Fisiopatologia MédicaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASOliveira, Renata Rocha, 1980-20192018-08-28T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf1 recurso online (126 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1637810OLIVEIRA, Renata Rocha. Mecanismo estrutural de regulação alostérica por potássio da enzima adenosina quinase: Structural mechanism of allosteric regulation by potassium of the enzyme adenosine kinase. 2019. 1 recurso online (126 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1637810. 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