Mecanismo estrutural de regulação alostérica por potássio da enzima adenosina quinase : Structural mechanism of allosteric regulation by potassium of the enzyme adenosine kinase

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Oliveira, Renata Rocha, 1980-
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1637810
Resumo: Orientador: Kleber Gomes Franchini
id UNICAMP-30_19a939080fc9656b98992d8b695ae8b5
oai_identifier_str oai::1096392
network_acronym_str UNICAMP-30
network_name_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository_id_str
spelling Mecanismo estrutural de regulação alostérica por potássio da enzima adenosina quinase : Structural mechanism of allosteric regulation by potassium of the enzyme adenosine kinaseStructural mechanism of allosteric regulation by potassium of the enzyme adenosine kinaseAdenosina quinaseRegulação alostéricaPotássioAdenosine kinaseAllosteric regulationPotassiumOrientador: Kleber Gomes FranchiniTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: A adenosina quinase (ADK -EC 2.7.1.20) é uma fosfotransferase responsável pela transferência catalítica do 'gama'-fosfato do ATP para adenosina (ADO). Essa reação desempenha um papel fundamental na regulação de níveis celulares de adenosina e, desta forma, interfere em diversos mecanismos homeostáticos e fisiopatológicos (e.g. inflamação, isquemia, etc). A reação catalítica da ADK, envolve regulação complexa pelos substratos e produtos, bem como por Mg2+ e fosfato inorgânico. Apresentamos neste trabalho, duas novas estruturas cristalinas da ADK murina, sendo um complexo binário na presença do substrato ADO (mADK:ADO) e um complexo ternário na presença de ambos ADO e ADP (mADK:ADO:ADP). No complexo ternário, além dos substratos, identificamos íons regulatórios essenciais para sua atividade catalítica, e de forma inédita, um íon K+ foi encontrado ligado entre regiões de alças adjacentes ao sítio de interação com o ATP. Neste sítio, o K+ liga-se de forma hexacoordenada às cadeias principal e lateral do Asp310 e a cadeia principal da Asn312, aminoácidos integrantes de um motivo que compõe um anion hole em quinases. Sua hexacoordenação completa-se através da interação com cadeias laterais da Ile330, Arg333 e Gly335 a partir da alça de extensão C-terminal da enzima. Ensaios de ressonância magnética nuclear 2D 15N-1H HSQC revelaram que a ligação de K+ perturba o Asp310 e resíduos das hélices adjacentes ('alfa'11 e 'alfa'13), envolvendo uma transição para uma estrutura cataliticamente produtiva. Consistente com os dados estruturais, mutantes D310P e D310A mostraram-se cataliticamente deficientes, com perda da capacidade de resposta ao K+. Espectros de Diferença de Transferência de Saturação (STD) em experimentos de titulação de ATP'gama'S, forneceram evidências para a redução da afinidade do mutante D310P da mADK pelo ATP'gama'S. Além disso, demonstramos que aumento na concentração de K+ modula a atividade in vitro da mADK (aumento de 2,5 vezes; Kd aparente = 10,4 mM). Mecanisticamente, o K+ aumenta a eficiência catalítica (Kcat), mas não afeta a afinidade da mADK para os substratos ADO e ATP. A depleção intracelular inibe, enquanto o restabelecimento da concentração intracelular do K+ recupera completamente a atividade celular de ADK. De maneira geral, nossos resultados contribuem para o entendimento da cinética da ADK e estabelecem base estrutural para a ativação alostérica da ADK por K+. Ainda, os resultados de experimentos funcionais em células apontam para o papel central da ADK como componente de um sistema de regulação do metabolismo de purina por variações da concentração intracelular de K+Abstract: Adenosine kinase (ADK -EC 2.7.1.20) is a phosphotransferase responsible for the catalytic transfer of 'gama'-phosphate from ATP to adenosine (ADO). This reaction plays a key role in regulating cellular adenosine levels and thus interferes with various homeostatic and pathophysiological mechanisms (e.g. inflammation, ischemia, etc.). The catalytic reaction of ADK involves complex regulation by substrates and products, as well as by Mg2+ and inorganic phosphate. In this work, we report two new crystal structures of murine ADK, one binary complex in the presence of ADO (mADK: ADO) and one ternary complex in the presence of both ADO and ADP (mADK: ADO: ADP). In the ternary complex, besides the substrates, we identified essential regulatory ions for its catalytic activity, and for the first time, a K+ ion was found bound between loop regions adjacent to the ATP interaction site. At this site, K+ binds hexacoordinately in the main and side chains of the Asp310 and the Asn312 main chain, amino acids that form an anion hole in kinases. Its hexacoordination is complete through interaction with side chains of Ile330, Arg333 and Gly335 from the enzyme C-terminal extension loop. 2D 15N-1H HSQC nuclear magnetic resonance assays revealed that K+ binding disturbs Asp310 and adjacent helix residues ('alpha'11 and 'alpha'13), involving a transition to a catalytically productive structure. Consistent with the structural data, D310P and D310A mutants were catalytically deficient, with loss of K+ responsiveness. Saturation Transfer Difference (STD) spectra in ATP'gama'S titration experiments provided evidence for the reduction of D310P mutant affinity for ATP'gama'S. In addition, we demonstrated that an increase in K+ concentration modulates in vitro mADK activity (2.5-fold increase; apparent Kd = 10.4 mM). Mechanistically, K+ increases catalytic efficiency (Kcat), but does not affect mADK affinity for ADO and ATP substrates. Intracellular depletion inhibits, while reestablishing of the intracellular K+ completely recovers ADK cell activity. Overall, our results contribute to the understanding of ADK kinetics and establish a structural basis for allosteric activation of ADK by K+. Furthermore, the results of functional cell experiments suggest the central role of ADK as a component of a purine metabolism regulation system by intracellular K+ concentration variationsDoutoradoFisiopatologia MédicaDoutora em Ciências[s.n.]Franchini, Kleber Gomes, 1961-Cardoso, Alisson CamposOliveira, Juliana Ferreira deCarneiro, Everardo MagalhãesGonçalves, Danieli CristinaUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências MédicasPrograma de Pós-Graduação em Fisiopatologia MédicaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASOliveira, Renata Rocha, 1980-20192018-08-28T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf1 recurso online (126 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1637810OLIVEIRA, Renata Rocha. Mecanismo estrutural de regulação alostérica por potássio da enzima adenosina quinase: Structural mechanism of allosteric regulation by potassium of the enzyme adenosine kinase. 2019. 1 recurso online (126 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1637810. Acesso em: 3 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1096392Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDFporreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2020-01-02T15:33:45Zoai::1096392Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2020-01-02T15:33:45Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
dc.title.none.fl_str_mv Mecanismo estrutural de regulação alostérica por potássio da enzima adenosina quinase : Structural mechanism of allosteric regulation by potassium of the enzyme adenosine kinase
Structural mechanism of allosteric regulation by potassium of the enzyme adenosine kinase
title Mecanismo estrutural de regulação alostérica por potássio da enzima adenosina quinase : Structural mechanism of allosteric regulation by potassium of the enzyme adenosine kinase
spellingShingle Mecanismo estrutural de regulação alostérica por potássio da enzima adenosina quinase : Structural mechanism of allosteric regulation by potassium of the enzyme adenosine kinase
Oliveira, Renata Rocha, 1980-
Adenosina quinase
Regulação alostérica
Potássio
Adenosine kinase
Allosteric regulation
Potassium
title_short Mecanismo estrutural de regulação alostérica por potássio da enzima adenosina quinase : Structural mechanism of allosteric regulation by potassium of the enzyme adenosine kinase
title_full Mecanismo estrutural de regulação alostérica por potássio da enzima adenosina quinase : Structural mechanism of allosteric regulation by potassium of the enzyme adenosine kinase
title_fullStr Mecanismo estrutural de regulação alostérica por potássio da enzima adenosina quinase : Structural mechanism of allosteric regulation by potassium of the enzyme adenosine kinase
title_full_unstemmed Mecanismo estrutural de regulação alostérica por potássio da enzima adenosina quinase : Structural mechanism of allosteric regulation by potassium of the enzyme adenosine kinase
title_sort Mecanismo estrutural de regulação alostérica por potássio da enzima adenosina quinase : Structural mechanism of allosteric regulation by potassium of the enzyme adenosine kinase
author Oliveira, Renata Rocha, 1980-
author_facet Oliveira, Renata Rocha, 1980-
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Franchini, Kleber Gomes, 1961-
Cardoso, Alisson Campos
Oliveira, Juliana Ferreira de
Carneiro, Everardo Magalhães
Gonçalves, Danieli Cristina
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências Médicas
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
dc.contributor.author.fl_str_mv Oliveira, Renata Rocha, 1980-
dc.subject.por.fl_str_mv Adenosina quinase
Regulação alostérica
Potássio
Adenosine kinase
Allosteric regulation
Potassium
topic Adenosina quinase
Regulação alostérica
Potássio
Adenosine kinase
Allosteric regulation
Potassium
description Orientador: Kleber Gomes Franchini
publishDate 2018
dc.date.none.fl_str_mv 2018-08-28T00:00:00Z
2019
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
format doctoralThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv https://hdl.handle.net/20.500.12733/1637810
OLIVEIRA, Renata Rocha. Mecanismo estrutural de regulação alostérica por potássio da enzima adenosina quinase: Structural mechanism of allosteric regulation by potassium of the enzyme adenosine kinase. 2019. 1 recurso online (126 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1637810. Acesso em: 3 set. 2024.
url https://hdl.handle.net/20.500.12733/1637810
identifier_str_mv OLIVEIRA, Renata Rocha. Mecanismo estrutural de regulação alostérica por potássio da enzima adenosina quinase: Structural mechanism of allosteric regulation by potassium of the enzyme adenosine kinase. 2019. 1 recurso online (126 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1637810. Acesso em: 3 set. 2024.
dc.language.iso.fl_str_mv por
language por
dc.relation.none.fl_str_mv https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1096392
Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDF
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
1 recurso online (126 p.) : il., digital, arquivo PDF.
dc.publisher.none.fl_str_mv [s.n.]
publisher.none.fl_str_mv [s.n.]
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron:UNICAMP
instname_str Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron_str UNICAMP
institution UNICAMP
reponame_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
collection Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository.name.fl_str_mv Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository.mail.fl_str_mv sbubd@unicamp.br
_version_ 1809189154162999296

Registros relacionados