Desenvolvimento de metodologias de ligação cruzada "in vitro" e "in situ" para análise de estrutura e interação de proteínas por espectrometria de massas

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Amaral, Bruno César do, 1991-
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/16345
Resumo: Orientadores: Fabio Cesar Gozzo, Ronaldo Aloise Pilli
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spelling Desenvolvimento de metodologias de ligação cruzada "in vitro" e "in situ" para análise de estrutura e interação de proteínas por espectrometria de massasDevelopment of novel "in vitro" and "in situ" cross-linking methodologies for protein structure and interaction analysis by mass spectrometryEspectrometria de massaLigação cruzadaProteômica estruturalProteinas - EstruturaInteração proteína-proteínaMass spectrometryCross-linkingProteins - StructureProtein structureProtein-protein interactionsOrientadores: Fabio Cesar Gozzo, Ronaldo Aloise PilliTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de QuímicaResumo: Proteínas constituem a classe mais diversa e complexa de biomoléculas encontradas na natureza e são as principais efetoras dos processos bioquímicos em quaisquer células e organismos. Para serem ativas, porém, devem se encontrar em conformações (estruturas) específicas, atingidas no processo de enovelamento e, principalmente, a partir de interações com outras proteínas ou ligantes. Embora diversas metodologias consolidadas sejam utilizadas tanto na determinação da estrutura quanto da interação de proteínas, desenvolvimentos recentes tornam a técnica de ligação cruzada associada à espectrometria de massas muito atrativa em ambas as áreas de aplicação. A técnica consiste na união covalente entre resíduos reativos e espacialmente próximos através de um agente de ligação cruzada (ALC), que é uma molécula orgânica contendo dois ou mais grupos funcionais separados por uma cadeia espaçadora de tamanho conhecido. Quando dois resíduos são conectados pelo ALC, a adição de massa gerada é identificada por espectrometria de massas, e infere-se que tais resíduos estão distantes em até o comprimento da cadeia espaçadora, sendo essa informação utilizada para obtenção de dados da estrutura de proteínas individuais ou para mapear possíveis parceiros de interação. No contexto da análise estrutural, no primeiro capítulo deste trabalho foi desenvolvida uma nova metodologia de ligação cruzada utilizando o ácido adípico como agente de ligação cruzada como alternativa aos ésteres de NHS usados como padrão na área. Valendo-se de dupla ativação com EDC e HOBt, essa metodologia apresentou diversas vantagens, destacando-se a realização do experimento em meio totalmente aquoso, a adição de resíduos ácidos como grupos reativos, e a obtenção de um maior número de restrições de distância quando comparado ao DSS, mesmo com cadeia espaçadora menor. Ainda, também foram obtidos rendimentos de incorporação superiores ao DSS em baixas temperaturas como 4 e 15 °C, além do encurtamento do tempo de reação que costuma ser de algumas horas para até 15 minutos. Já no contexto de interações proteicas, no segundo capítulo iniciou-se o desenvolvimento de uma metodologia para ligação cruzada in situ, na qual a dinâmica celular foi interrompida pelas técnicas de crio-fixação e crio-substituição, seguidas da adição de um agente de ligação cruzada permeável à membrana, capaz de se ligar covalentemente a proteínas para mapear possíveis parceiros de interação. Utilizando-se anidridos de ácido monofuncionais, foram obtidas taxas expressivas de proteínas modificadas pelos reagentes, chegando a mais de 70% de todas as identificações, indicando que a aplicação da metodologia para captura de interações proteína-proteína intracelulares por ligação cruzada é muito promissoraAbstract: Proteins form the most complex and diverse class of biomolecules found in nature and are the main effectors of biochemical processes in any cell or organism. To be active, however, they must be in specific structural conformations, achieved during the folding process and, mainly, through interactions with other proteins or ligands. Even though several consolidated methods are used both in protein structure and protein interaction determination, recent developments have put a spotlight on cross-linking coupled to mass spectrometry as a promising method for both fields of study. The technique consists in covalently binding reactive and spatially close residues through a cross-linker, which is an organic molecule that has two or more functional groups separated by a spacer arm of known length. When two residues are connected by the cross-linker, the correspondent mass addition is identified by mass spectrometry, and it can be inferred that the connected residues are within the reach of the spacer arm. This distance restraint between residues is used to obtain structural information of individual proteins or to map its possible interaction partners. In the context of structural analysis, in the first chapter of this work a novel cross-linking methodology was developed using adipic acid as a cross-linker as an alternative to NHS-esters, the current standard cross-linkers. Through a double activation process using EDC and HOBt, the developed methodology presented several advantages, being noteworthy the possibility of conducting the experiment in full aqueous medium, the incorporation of acidic residues as reactive groups, and the generation of more cross-linked species and distance restraints when compared to DSS even with a shorter spacer arm. Moreover, still comparing to DSS, superior incorporation yields were obtained in low temperatures such as 4 and 15 °C, while reaction times could be shortened from a couple of hours to up to 15 minutes. In the context of protein interactions, however, in the second chapter the development of a novel methodology for in situ cross-linking was initiated, in which cellular dynamics was interrupted using cryo-fixation and freeze-substitution, followed by the incubation with a membrane-permeable cross-linker capable of covalently attach itself to proteins in order to map possible interaction partners. Using monofunctional acid anhydrides, significant yields of labeled proteins were obtained, reaching over 70% of all identifications, indicating that the use of this method to probe protein-protein interactions in the intracellular environment is very promisingAbertoDoutoradoQuímica OrgânicaDoutor em CiênciasCNPQ165432/2017-9CAPES001[s.n.]Gozzo, Fábio Cesar, 1972-Pilli, Ronaldo Aloise, 1955-Ramos, Carlos Henrique InacioJurberg, Igor DiasFerreira, Ana Gisele da Costa NevesCarvalho, Paulo CostaUniversidade Estadual de Campinas. Instituto de QuímicaPrograma de Pós-Graduação em QuímicaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASAmaral, Bruno César do, 1991-20212021-08-10T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf1 recurso online (137 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/16345AMARAL, Bruno César do. Desenvolvimento de metodologias de ligação cruzada "in vitro" e "in situ" para análise de estrutura e interação de proteínas por espectrometria de massas. 2021. 1 recurso online (137 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/16345. Acesso em: 15 mai. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1377575porreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2024-04-02T21:47:20Zoai::1377575Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2024-04-02T21:47:20Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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