Purificação da glicoproteina G (GPV) recombinante do virus da raiva produzida por celulas de Drosophila Melanogaster S2 atraves de cromatografia de afinidade por ions metalicos imobilizados

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Silva, Paula Timoteo da
Data de Publicação: 2007
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1605536
Resumo: Orientador: Sonia Maria Alves Bueno
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spelling Purificação da glicoproteina G (GPV) recombinante do virus da raiva produzida por celulas de Drosophila Melanogaster S2 atraves de cromatografia de afinidade por ions metalicos imobilizadosPurification of the recombinant rabies virus G glycoprotein (GPV) produced by Drosophila melanogaster S2 cells using immobilized metal ion affinity chromatographyCromatografia de afinidadeÍons metálicosQuelantesProteínas - PurificaçãoHidrofobiaRabies virus glycoproteinPurificationIMACRabies vaccineOrientador: Sonia Maria Alves BuenoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia QuímicaResumo: Raiva ou hidrofobia é uma infecção viral que atinge o sistema nervoso central, ocorrendo em animais e humanos. As proteínas principais encontradas no vírus da raiva que atuam ativando o sistema imune são a nucleoproteína N (NPV) e a glicoproteína G, uma proteína transmembrana que forma o envelope viral e induz a produção de anticorpos neutralizantes que protegem contra o ataque viral. Este trabalho visou a purificação da glicoproteína G do vírus da raiva com cauda de polihistidina (GPV) a partir do lisado e do sobrenadante da cultura de células de inseto Drosophila melanogaster Schneider 2 (S2AcGPV2), transfectadas com o vetor pAc 5.1/V5-His A contendo o gene da GPV, empregando cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC). Os aspectos abordados neste trabalho foram a derivatização do gel de agarose com o agente quelante ácido iminodiacético (agarose-IDA) e a avaliação da seletividade, capacidade e reprodutibilidade do gel de agarose-IDA-Ni2+ na adsorção da GPV em função de diferentes sistemas tamponantes e de diferentes estratégias de dessorção de GPV (abaixamento de pH ou aumento da concentração de agente competitivo). A seletividade em cada sistema tamponante foi determinada por eletroforese SDSPAGE das frações dos picos de proteína obtidos nas cromatografias e a quantificação de GPV presente nas frações cromatográficas foi realizada através de ensaios do tipo ELISA. A melhor condição utilizada para a purificação da glicoproteína G foi a alimentação de lisado de células em coluna contendo agarose-IDA-Ni2+ equilibrada com tampão fosfato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 500 mM, imidazol 2 mM pH 7,0. A lavagem foi realizada com tampão fosfato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 500 mM, imidazol 2 mM pH 6,0 e a eluição por aumento de concentração de imidazol para 200 e 500 mM. Os resultados demonstraram a potencialidade de utilização do método de IMAC para a purificação da glicoproteína G do vírus da raivaAbstract: Rabies or hydrophobia is a viral infection that affects the central nervous system, occuring in animals and humans. The main proteins found in rabies virus that activates the immunological system are the N nucleoprotein (NPV) and the G glycoprotein, a transmembrane protein that forms the spikes of the virus and induces virus-neutralizing antibodies that protect against infection. This research aimed at the purification of the rabies virus glycoprotein containing a polyhistidine tag (GPV) from lisate and supernatant of Drosophila melanogaster Schneider 2 (S2AcGPV2) cells culture, transfected with the vector pAc 5.1/V5-His A containing the GPV gene, using immobilized metal íon affinity chromatography (IMAC). The aspects developed in this project were the agarose gel derivatization with the chelating agent iminodiacetic acid (IDA) and the evaluation of the agarose-IDA-Ni2+ gel seletivity, capacity and reproductibility at the GPV adsorption, regarding different buffer systems and different GPV's desorption strategies (lowering the pH of the buffer or increasing the concentration of a competitive agent in the buffer). The seletivity in each buffer system was determined by performing SDS-PAGE electrophoresis on the chromatographic samples with the larger concentration of proteins, and the GPV quantification in these samples was determined by ELISA assays. The best results of purification were found when lisate was fed into an agarose-IDA-Ni2+ column equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer containing 500 mM sodium chloride and 2 mM imidazole pH 7,0. The washing step was proceeded with 20 mM sodium phosphate buffer containing 500 mM sodium chloride and 2 mM imidazole pH 6,0 and the elution proceeded by raising the imidazole concentration at the wash buffer to 200 e 500 mM. The results demonstrated the potencial of using IMAC to purify rabies virus G glycoproteinDoutoradoDesenvolvimento de Processos BiotecnológicosMestre em Engenharia Química[s.n.]Bueno, Sonia Maria Alves, 1961-Moraes, Angela MariaTamashiro, Wirla Maria da Silva CunhaMendonça, Ronaldo ZucatelliUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Engenharia QuímicaPrograma de Pós-Graduação em Engenharia QuímicaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASSilva, Paula Timoteo da20072007-04-23T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf103 p. : il.(Broch.)https://hdl.handle.net/20.500.12733/1605536SILVA, Paula Timoteo da. Purificação da glicoproteina G (GPV) recombinante do virus da raiva produzida por celulas de Drosophila Melanogaster S2 atraves de cromatografia de afinidade por ions metalicos imobilizados. 2007. 103 p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1605536. 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