Análise proteômica global comparativa de tecidos periodontais provenientes de dentes decíduos e permanentes humanos : Global proteome comparative analysis of periodontal tissues from deciduous and permanent human teeth

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Giovani, Priscila Alves, 1990-
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1640626
Resumo: Orientadores: Kamila Rosamilia Kantovitz, Regina Maria Puppin-Rontani
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Juntos, desempenham um papel crítico na ancoragem dentária. Faltam informações sobre o padrão molecular dos tecidos periodontais dos decíduos (Dec) e permanentes (Perm). A presente tese caracterizou o proteoma da membrana das células do PDL e da matriz extracelular do DC a fim de distinguir as dentições. Proteínas foram extraídas da membrana celular de culturas primárias de DecPDL (n=3) e PermPDL (n=3) e da matriz extracelular do cemento de 25 Dec e 12 Perm, agrupados em pools de DecDC (n=5) e PermDC (n=4) e analisadas por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS/MS). O teste estatístico beta-binomial foi aplicado aos spectrum counts normalizados para determinar as proteínas diferencialmente expressas (PDE) (p <0,05). Os achados para PDL foram validados por reação em cadeia da polimerase quantitativa e ensaios de Western blot em tecidos humanos frescos (n=8) e culturas primárias (n=6). Além disso, verificou-se via microscopia confocal a expressão de proteínas alvo nas culturas de PDL. Diferentemente, imuno-histoquímica foi usada para validar as proteínas selecionadas do DC. No PDL, detectou-se um total de 752 proteínas: 142 exclusivas aos DecPDL, 115 exclusivas aos PermPDL e 495 comuns. Sendo 23 PDE: 3 mais abundantes em DecPDL e 10 encontradas exclusivamente em DecPDL; 2 mais abundantes em PermPDL e 8 exclusivas em PermPDL. A análise comparativa de gene ontology (GO) em PDL evidenciou que a maioria das diferenças envolveram o sistema endomembrana (PICALM, STX4 e LRP10), atividade da hidrolase (NCSTN e XRCC6), ligação proteica (PICALM, STX4, GPNMB, VASP, ESYT2 e LRRC15) e atividade de isomerase (FKBP8). Ao nível de transcrição, confirmou-se a tendência de maior expressão de PICALM em DecPDL e de ESYT2 e LRRC15 em PermPDL, reproduzindo os achados proteômicos em tecidos frescos do PDL. Além disso, confirmou-se via Western blot níveis aumentados de PICALM, LRRC15 e ESYT2 em células e/ou tecidos frescos, e via microscopia confocal as tendências para expressão de PICALM e LRRC15 em células do PDL. Em DC, identificou-se um total de 510 proteínas: 123 exclusivas para DecDC, 128 exclusivas para PermDC e 259 comuns. Das 60 PDE, 17 foram mais abundantes em DecDC, incluindo MPO (exclusiva em DecDC [p <0,05]), enquanto 43 foram mais abundantes em PermDC, incluindo DCN e BGLAP (aumentadas em PermDC [p <0,05]). A análise de GO indicou proteínas relacionadas a processos biológicos que incluíam localização e resposta ao stress; e PDE enriquecidas para função molecular em adesão celular, ligação molecular, ligação proteica de citoesqueleto, atividade molecular estrutural e ligação do complexo macromolecular. A imuno-histoquímica confirmou as tendências para PDE selecionadas em dentes humanos. Relatamos a primeira caracterização abrangente da maquinaria proteômica de membrana de células do PDL e da matriz extracelular do DC de Dec vs. Perm. Juntos, identificamos um perfil molecular distinto para essas dentições, incluindo proteínas exclusivasAbstract: The periodontal ligament (PDL) is a highly specialized connective tissue that connects the tooth to the alveolar bone, while the dental cementum (DC) is a mineralized, avascular connective tissue that covers the root dentin and its main function is the insertion of fibers from the periodontal ligament to the tooth root. Together, these tissues play a critical role in tooth anchorage. There is a lack of information regarding the molecular signature of deciduous (DecPDL) and permanent (PermPDL) periodontal tissues. The present thesis characterized the proteome of the cell membrane of the PDL and the extracellular matrix of the DC in order to identify distinctions between the dentitions. Proteins were extracted from the cell membrane of primary cultures for DecPDL (n=3) and PermPDL (n=3) and from extracellular matrix of dental cementum 25 Dec and 12 Perm, grouped in pools for DecDC (n=5) and PermDC (n=4) and analyzed by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). The beta-binomial test applied to spectrum counts determined differentially expressed proteins (PDE) (p <0,05). PDL proteome findings were validated by quantitative polymerase chain reaction and Western blot assays in fresh human tissues (n=8) and primary cell cultures (n=6). In addition, confocal microscopy was used to verify the expression of target factors in the PDL cell cultures. Otherwise, Immunohistochemistry was applied to validate selected proteins of DC. In PDL a total of 752 proteins were detected: 142 exclusive to DecPDL, 115 exclusive to PermPDL and 495 common. 23 were PDE: three with higher abundance in DecPDL and 10 found exclusively in DecPDL cells; two proteins with higher abundance in PermPDL and eight found to be exclusive for PermPDL cells. Comparative gene ontology enrichment analysis (GO) in PDL evidenced that the most stickling differences involved "endomembrane system" (PICALM, STX4, and LRP10), "hydrolase activity" (NCSTN and XRCC6), "protein binding" (PICALM, STX4, GPNMB, VASP, ESYT2, and LRRC15), and "isomerase activity" (FKBP8). At the transcript level, high PICALM in DecPDL and ESYT2 and LRRC15 in PermPDL, reproducing the proteomic findings in fresh PDL tissues. Furthermore, Western blot analysis confirmed increased levels of PICALM, LRRC15, and ESYT2 in cells and/or fresh tissues, and confocal microscopy confirmed the trends for PICALM and LRRC15 expression in PDL cells. In DC a total of 510 proteins were identified: 123 exclusive to DecDC, 128 exclusive to PermDC and 259 common. Among the 60 PDE, 17 were higher in DecDC, including MPO (found exclusively in DecDC [p < 0.05]), whereas 43 were higher in PermDC, including DCN and BGLAP (higher in PermDC [p < 0.05]). Overall, GO analysis indicated that proteins were related to Biological Processes that included localization and response to stress; and PDE were enriched in cell adhesion, molecular binding, cytoskeletal protein binding, structural molecular activity and macromolecular complex binding. Immunohistochemistry confirmed the trends for selected PDE in human teeth. We report the first comprehensive characterization of the membrane protein machinery of DecPDL vs. PermPDL cells, and of extracellular matrix of DecDC vs. PermDC. Together, we identified a distinct molecular profile for these dentitions, including unique proteinsDoutoradoOdontopediatriaDoutora em OdontologiaFAPESP2016/02942-1; 2019/13242-9[s.n.]Kantovitz, Kamila Rosamilia, 1975-Puppin-Rontani, Regina Maria, 1959-Paiva, Saul Martins dePordeus, Isabela AlmeidaSantos, Eduardo César AlmadaSteiner-Oliveira, CarolinaUniversidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de PiracicabaPrograma de Pós-Graduação em OdontologiaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASGiovani, Priscila Alves, 1990-20202020-12-14T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf1 recurso online ( 93 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1640626GIOVANI, Priscila Alves. Análise proteômica global comparativa de tecidos periodontais provenientes de dentes decíduos e permanentes humanos : Global proteome comparative analysis of periodontal tissues from deciduous and permanent human teeth . 2020. 1 recurso online ( 93 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Piracicaba, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1640626. 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