"Genome mining" e estratégias de clonagem para caracterização de vias biossintéticas de PKS e NRPS em "Streptomyces" sp. CBMAI 2042

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Sigrist, Renata, 1988-
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1637736
Resumo: Orientador: Luciana Gonzaga de Oliveira
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spelling "Genome mining" e estratégias de clonagem para caracterização de vias biossintéticas de PKS e NRPS em "Streptomyces" sp. CBMAI 2042"Genome mining" and cloning strategies for characterization of PKS and NRPS biosynthetic pathways from "Streptomyces" sp. CBMAI 2042StreptomycesProdutos biológicosMineração do genomaStreptomycesNatural productsGenome miningOrientador: Luciana Gonzaga de OliveiraTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de QuímicaResumo: Actinobacteria é um filo de bactérias Gram-positivas que habitam ambientes terrestres ou aquáticos e são de grande relevância para a pesquisa acadêmica e a indústria farmacêutica devido ao grande potencial de biossintetizar diferentes classes de produtos naturais. Os policetídeos e os peptídeos não ribossomais destacam-se por combinar alta complexidade estrutural a uma ampla gama de atividades terapêuticas, tais como antibiótica, antitumoral e imonussupressora. Os genes biossintéticos que codificam para enzimas produtoras desses compostos podem ser mapeados pelo sequenciamento e genome mining de diferentes linhagens de Streptomyces, de modo a auxiliar e agilizar a busca por novos e importantes alvos terapêuticos. O microrganismo endofítico Streptomyces sp. CBMAI 2042, isolado de Citrus sinensis, foi sequenciado e a análise in silico do genoma permitiu identificar um cluster de genes órfão composto por uma PKS do tipo 1, trans-AT PKS e NRPS. O estudo aqui apresentado visou a clonagem desse cluster de genes biossintético através de bibliotecas genômicas em vetores do tipo BAC e ESAC (empresa Bio S&T) e de técnicas de recombinação de DNA, como l- RED, Gibson Assembly® e TAR-cloning, para posterior expressão em organismo heterólogo S. coelicolor. O cluster órfão obtido via TAR-cloning e expresso em S. coelicolor M1146 foi associado a produção de alpiniamida. A deleção do domínio de adenilação confirmou a correlação da via de biossíntese com a molécula isolada e caracterizada. Experimentos com precursores marcados embasaram a proposta de biossíntese dessa via mista trans-AT PKS/NRPS. Adicionalmente, o cluster de genes codificando para biossíntese da valinomicina, composto já descrito na literatura e produzido majoritariamente pela linhagem selvagem em diferentes cultivos, foi identificado no genoma e foi também selecionado para triagem de clones na biblioteca genômica. A clonagem e expressão heteróloga levou ao incremento de três vezes a produção do metabólito. Além disso, a associação da estratégia de molecular networking, levou a identificação de pelo menos seis análogos estruturais, entre eles a montanastatina, sendo pela primeira vez associados a mesma via de biossínteseAbstract: Actinobacteria is a phylum of Gram-positive terrestrial or aquatic bacteria of significant importance for academic research and pharmaceutical industries due to their great potential to biosynthesize different types of natural products. Polyketides and nonribosomal peptides are produced by enzymes known as polyketide synthases and nonribosomal synthetase and stand out by combining high structural complexity with a wide range of therapeutic activities, such as antibiotics, antitumor and immunosuppressor. In order to accelerate identification of new therapeutic compounds, the biosynthetic genes encoding to these and other class of enzymes can be mapped by genome sequence and mining of different Streptomyces strains. The endophytic strain Streptomyces sp. CBMAI 2042, isolated from Citrus sinensis, was sequenced and in silico analysis endorsed identification of the orphan biosynthetic genes comprising a type I PKS, trans-AT PKS and NRPS. This study aimed to obtain this biosynthetic gene cluster from genomic libraries constructed in BAC and ESAC vectors and by recombination methodologies l- RED, Gibson Assembly® and TAR- cloning, followed by heterologous expression in S. coelicolor. The orphan cluster obtainen by TAR-cloning and transferred to S. coelicolor M1146 was associated to alpiniamide biosynthesis. Deletion of adenylation domain confirmed the biosynthetic origin of isolated molecule and experiments with labeled precursors embased the proposed biosynthetic steps for assembly of alpiniamide. Additionally, the gene cluster related to biosynthesis of the already described valinomycin was identified from genome annotation and also screened for clones in the genomic library, as it is the major metabolite produced by CBMAI 2042. Cloning and heterologous expression in S. coelicolor M1146 resulted in 3 times increase in production of valinomycin and association with molecular networking allowed the identification of at least six analogues, including montanastatin, related for the first time to the same biosynthetic pathwayDoutoradoQuímica OrgânicaDoutora em CiênciasFAPESP2015/01013-4[s.n.]Oliveira, Luciana Gonzaga de, 1975-Trivella, Daniela Barretto BarbosaPupo, Mônica TallaricoVieira, Paulo CezarMarsaioli, Anita JocelyneUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de QuímicaPrograma de Pós-Graduação em QuímicaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASSigrist, Renata, 1988-20192019-07-30T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf1 recurso online (177 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1637736SIGRIST, Renata. "Genome mining" e estratégias de clonagem para caracterização de vias biossintéticas de PKS e NRPS em "Streptomyces" sp. CBMAI 2042. 2019. 1 recurso online (177 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1637736. Acesso em: 3 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1096008Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDFporreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2019-12-12T11:05:55Zoai::1096008Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2019-12-12T11:05:55Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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