Identificação e caracterização de compostos com propriedades antivirais contra o vírus chikungunya a partir de um ensaio fenotípico : Identification and evaluation of compounds with antiviral proprieties against chikungunya infection using a phenotypic screening strategy

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Bonotto, Rafaela Milan, 1989-
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1636934
Resumo: Orientador: Holanda Gondim de Freitas Junior
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Na última epidemia, em 2016, ocorreu aumento de novos casos no Brasil em consequência da falta de profilaxia ou terapias para conter a doença. Com isso, estudos focados em antivirais são de extrema importância para a descoberta e desenvolvimento de um novo fármaco para futura aplicação na sociedade. Para esse fim, este trabalho teve o objetivo de desenvolver um ensaio celular fenotípico, no qual foi possível realizar triagens com bibliotecas de compostos farmacologicamente ativos e/ou clinicamente aprovados contra a infecção de CHIKV in vitro. O ensaio foi baseado na metodologia de triagem de alto conteúdo (HCS, High Content Screening), sendo a infecção em células de linhagens humanas Huh 7 por CHIKV imageada e quantificada por meio de imunofluorescência e análise automatizada de imagens. O ensaio foi validado, demonstrando-se robusto e reprodutível, com valor de fator-Z¿ > 0,8, com coeficiente de variação <10% e correlação com r de 0,9. Foram, então, realizadas duas triagens primárias e um estudo em dose resposta de compostos antivirais. Dessas triagens, 4 compostos candidatos foram priorizados para ensaios complementares, nos quais isetionato de pentamidina, brequinar sódico, cloreto de dequalínio e sofosbuvir apresentaram atividade concentração-dependente para diferentes linhagens de CHIKV com seletividade em células Huh 7. Além disso, o tratamento com esses compostos causou uma redução no número total de partículas virais infectivas in vitro, demonstrando serem bons candidatos antivirais. Por fim, estudos de mecanismo de ação demonstraram que a atividade antiviral de isetionato de pentamidina e cloreto de dequalinio está associada a etapas iniciais do ciclo viral de CHIKV, de entrada e início da replicação. Este trabalho estabeleceu um ensaio robusto e confiável baseado na metodologia de HCS para CHIKV, no qual foi possível realizar triagens com coleções de moléculas diversificadas, que resultou na identificação e caracterização de moléculas novas contra infecção viral in vitro, como promissores candidatos antivirais para CHIKVAbstract: Chikungunya fever is an emerging disease caused by Chikungunya virus, which is associated with significant public health problem in tropical countries. Recently reported outbreaks in Brazil in 2016 drew attention to the need to develop prevention and treatment options, as no antiviral chemotherapy or vaccines are currently available for this disease. Thereby, to address drug discovery needs, the present work proposes the development a phenotypic screening strategy for CHIKV by screening a collection of compounds pharmacologically activity compounds, including FDA-approval drugs, and a panel of broad-spectrum antiviral compounds. The assay was based a high content screening methodology (HCS), which was developed by infecting the human hepatoma Huh-7 cells with CHIKV 181/25 and quantifying infection through indirect immunofluorescence. Assay robustness was confirmed with Z¿-factor values >0.8 , coefficient of variation < 10% and high correlation coefficient between independent runs with r of 0.9 , demonstrating that the assay is reliable, consistent and reproducible. In total were selected 4 compounds with promising activity were selected to conduct complementary in vitro assay. The compounds pentamidine isethionate, brequinar sodium, dequalinium chloride and sofosbuvir showed activity dependent on concentration in different CHIKV strains, with high selective indexes in Huh 7 cell line. Moreover, all compound treatment significantly reduced CHIKV infectivity titer in vitro showing a promising antiviral candidates. Thus, further evolution of pentamidine isethionate and dequalinium chloride point they might act an early CHIKV stage viral infection cycle, such as binding, internalization and initial replication phase. Here we presented a robust and reliable HCS phenotypic method to screening compounds against CHIKV which provide to identified and characterized promising compounds candidate as starting point therapeutic development against CHIKVDoutoradoMicrobiologiaDoutora em Genética e Biologia MolecularCAPESFAPESP2016/03780-5CNPEM[s.n.]Freitas-Junior, Lucio Holanda, 1968-Gil, Laura Helena Vega GonzalesMódena, José Luiz ProençaDurigon, Edison LuizOliveira, Juliana Velasco de CastroUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Genética e Biologia MolecularUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASBonotto, Rafaela Milan, 1989-20192019-04-29T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf1 recurso online (135 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1636934BONOTTO, Rafaela Milan. Identificação e caracterização de compostos com propriedades antivirais contra o vírus chikungunya a partir de um ensaio fenotípico: Identification and evaluation of compounds with antiviral proprieties against chikungunya infection using a phenotypic screening strategy. 2019. 1 recurso online (135 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1636934. 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