Produção de proteinas recombinantes utilizando Escherichia coli em cultivos em alta densidade celular

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Lima, William James Nogueira
Data de Publicação: 2004
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1599486
Resumo: Orientador: Maria Helena Andrade Santana
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spelling Produção de proteinas recombinantes utilizando Escherichia coli em cultivos em alta densidade celularBiotecnologia - MicrobiologiaFermentaçãoMembranas (Tecnologia)DNA recombinanteMicrobiologia industrialOrientador: Maria Helena Andrade SantanaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de QuimicaResumo: Neste trabalho foi possível estudar o cultivo em altas densidades celulares de E. coli recombinante em bioreatores identificando importantes parâmetros cinéticos para as fases de crescimento celular e indução da proteína recombinante. Foram estudadas diversas estratégias de cultivo para obtenção de elevadas densidades celulares, no intuito de desenvolver' uma tecnologia de fermentação robusta que permitisse: Elevados níveis de biomassa em peso seco de células por litro; determinar as condições nutricionais que permitem expressão da proteína de fusão da ordem de 20% ou mais em fermentações com alta concentração de biomassa e determinar a melhor estratégia de fermentação para atingir elevadas concentrações celulares, entre as quais, batelada-alimentada com cortes, batelada-alimentada cíclica em dois estágios e fermentações com reciclo e microfiltração. A cepa utilizada neste estudo foi a E. coli N-4830-1 transformada com o plasmídeo pHis. As fermentações foram realizadas em bioreatores de bancada de capacidade útil de 4,0 L e 12,0 L (NBS e Inceltech). Foram medidas as concentrações de biomassa, glicose, acetato e proteína recombinante. Os estudos cinéticos das diferentes estratégias mostraram incrementos em biomassa e em proteína de fusão, sendo que o melhor resultado foi obtido para fermentações com reciclo total de células, microfiltração do meio e alimentação exponencial de nutrientes, as quais obtiveram produtividade celular igual a PR = 6,437 g/L/h. A concentração final em peso seco de células foi 173,8 g/L, com porcentagem de expressão da proteína de fusão em 17,8%. Os incrementos obtidos em biomassa e em proteína de fusão, em relação à batelada-alimentada tradicional, foram respectivamente 341 % e 328 %. A técnica mostrou-se adequada para remoção de inibidores no meio de cultura permitindo maior produtividade e, conseqüentemente, maior crescimento celular, sendo até 3,5 vezes superiores aos cultivos em batelada-alimentada tradicionalAbstract: This thesis studied submerged high cell-density cultures (HCDC) of recombinant Escherichia coli identifying important kinetic parameters on growth and production phases. Several strategies to obtain HCDC were studied aiming to develop a robust fermentation process that allowed: High cell dry weight per liter; to determine the nutritional conditions to express the fusion protein in levels up to 20% of total protein, and to determine the best fermentation technique to reach dry biomass concentration higher that 100,0 g/L. The strain used in this work was E. colí N-4830-1 transformed with the plasmid pHis. The fermentations were ran out in 4.0 L and 12.0 L bench-top bioreactors (NBS e Inceltech). Total protein concentration, recombinant protein concentration, cell concentration, glucose concentration and acetate concentration were analyzed. The kinetics studies demonstrated that biomass and fusion protein were increased, however the best results were performed on a continuous fermentation with microfiltration, total cell recycle and exponencial feeding. The cell productivity was PR = 6,437 glUh, the final cell dry weight was 173,8 g/L and the percentage of fusion protein was 17,8 % of total protein. The biomass and fusion protein increase obtained were, respectively, 341 % and 328 %, comparing with traditional fed-batch fermentation. This technique showed appropriated to remove inhibitors of the broth allowing higher cell concentration and, consequently, higher productivity. In this type of culture strategy, the final cell concentration was 3.5 fold than one obtained in traditional fed-batchDoutoradoDesenvolvimento de Processos BiotecnológicosDoutor em Engenharia Química[s.n.]Santana, Maria Helena Andrade, 1951-Pradella, Jose Geraldo da CruzAndrietta, Silvio RobertoSilva, Daison OlzanyMaugeri Filho, FranciscoUniversidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia QuimicaPrograma de Pós-Graduação não informadoUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASLima, William James Nogueira20042004-06-12T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf157 p. : il.(Broch.)https://hdl.handle.net/20.500.12733/1599486LIMA, William James Nogueira. Produção de proteinas recombinantes utilizando Escherichia coli em cultivos em alta densidade celular. 2004. 157 p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Quimica, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1599486. 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