Estudo de isolados sequenciais de Aspergillus fumigatus : igilância de resistência aos azólicos e caracterização molecular

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Pontes, Laís, 1992-
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/12017
Resumo: Orientador: Angélica Zaninelli Schreiber
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spelling Estudo de isolados sequenciais de Aspergillus fumigatus : igilância de resistência aos azólicos e caracterização molecularStudy of sequential isolates of Aspergillus fumigatus : azole-resistance surveillance and molecular characterizationFungos filamentososInfecções oportunistasAspergillus fumigatusFarmacorresistência fúngicaAspergiloseFilamentous fungiOpportunistic infectionsAspergillus fumigatusDrug resistance, FungalAspergillosisOrientador: Angélica Zaninelli SchreiberTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: Aspergillus spp. são considerados patógenos oportunistas que são responsáveis por altas taxas de mortalidade, sendo os antifúngicos azólicos a primeira escolha para tratamento. No início dos anos 2000 foram encontrados Aspergillus fumigatus resistentes a esta classe de antifúngicos, que possuem mutações principalmente no gene CYP51A. No Brasil, atualmente, já foram descritas seis cepas de A. fumigatus portadores de mutações no gene da CYP51A, quatro delas encontradas na nossa instituição, tornando-se necessária a vigilância do surgimento de outras cepas, uma vez que o Hospital de Clínicas da Unicamp recebe diariamente muitos pacientes de alto risco que são suscetíveis a infecções oportunistas. Este trabalho avaliou a ocorrência e o perfil de suscetibilidade de Aspergillus sp. originários de 46 pacientes aos antifúngicos azólicos; analisou a presença de mutações no gene CYP51A dos isolados resistentes ou que foram positivos na Surveyor Nuclease; realizou busca de mutações no gene hmg1 em isolados resistentes que não possuíam mutações na CYP51A, seguida da genotipagem por microssatélite. Trezentos e vinte e oito isolados clínicos foram estudados. Para identificar as espécies de Aspergillus foram realizados os sequenciamentos de DNA das regiões especificas dos genes ?tubulina e calmodulina. A determinação da concentração inibitória mínima foi avaliada de acordo com o documento M38-A2 do CLSI, 2008 frente à itraconazol, voriconazol e posaconazol. Os isolados considerados resistentes aos azólicos e isolados que apresentaram bandas específicas na Surveyor Nuclease foram submetidos ao sequenciamento do gene CYP51A. A genotipagem foi realizada por microssatélites. Foram identificados 305 (93%) A. fumigatus, seguido de 14 (4,2%) A. flavus. Foram encontrados cinco isolados de A. fumigatus que apresentaram valores elevados de CIM >2µg/mL para itraconazol ou voriconazol. Na análise do gene CYP51A, o conjunto de mutações TR34/L98H/S297T/F495I foi encontrado nos isolados LIF 2444-6 e LIF 2552-4.9 pertencentes a pacientes distintos; a troca de aminoácidos G448S foi encontrada nos isolados LIF 3546 e LIF 3608 pertencentes ao mesmo paciente; e, o isolado LIF 2328 que apresentou altos CIMs para ITC, VRC e POS não apresentou nenhuma mutação no gene CYP51A e hmg1. Na Surveyor Nuclease e microssatélites, foram avaliados cento e três isolados de A. fumigatus originários de sete pacientes portadores de fibrose cística. A Surveyor Nuclease evidenciou onze isolados que poderiam ter mutação no gene da CYP51A através de bandas específicas que foram visualizadas em gel de agarose, porém, somente sete isolados apresentavam mutações pontuais já conhecidas: as mutações F46Y, M127V, N248T, D225E e E427K e a substituição de aminoácidos N248K. Quanto à genotipagem, os isolados de A. fumigatus apresentaram três complexos clonais distintos. Apesar da existência destes complexos clonais, os pacientes estudados não tinham contato entre si, sendo o único contato provado o ambiente Hospitalar (Ambulatório de Pneumologia do HC-UNICAMP). São necessários outros estudos para compreender a epidemiologia e a heterogeneidade de A. fumigatus, além da elucidação de outros mecanismos que estão diretamente envolvidos na resistência do mesmo à azólicos, tornando a sua vigilância imprescindível, visto que se mostrou um importante patógeno emergente nas infecções em pacientes na nossa instituiçãoAbstract: Aspergillus spp. are opportunistic pathogens responsible for high mortality rates, and azole antifungals are the first choice for aspergillosis treatment. In the early 2000s, azole-resistant Aspergillus fumigatus, generally due to mutations in the CYP51A gene, was first reported. To date in Brazil, six strains of A. fumigatus carrying mutations in the CYP51A gene have been described, four of which were found in our institution, making the surveillance for the emergence of other strains important, as the Hospital de Clínicas da Unicamp daily receives many high-risk patients, susceptible to opportunistic infections. This study evaluated the occurrence and susceptibility profile of Aspergillus sp. originating from 46 patients to azole antifungals; analyzed the presence of mutations in the CYP51A gene of resistant isolates or isolated that presented positive results in the Surveyor Nuclease assay; searched for mutations in the hmg1 gene of resistant isolates that did not carry mutations in CYP51A, and performed the microsatellite genotyping. 328 clinical isolates were studied. The DNA sequencing of the ?-tubulin and calmodulin regions was performed to identify Aspergillus species. Minimum inhibitory concentration (MIC) was determined according to the CLSI document M38-A2, against Itraconazole, Voriconazole, and Posaconazole. Azole-resistant isolates and isolates that showed specific bands in the Surveyor Nuclease assay underwent CYP51A gene sequencing. Microsatellite genotyping was performed using the following oligonucleotides: 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 4A, 4B, and 4C. 305 (93%) A. fumigatus isolates and 14 (4.2%) A. flavus isolates were identified. 5 A. fumigatus isolates presented elevated MIC values (>2 µg/mL) for ITC or VRC. In the analysis of the CYP51A gene, the combination of TR34/L98H/S297T/F495I mutations was found in isolates LIF 2444-6 and LIF 2552-4.9 from different patients. The G448S amino acid substitution was found in isolates LIF 3546 and LIF 3608 from the same patient. Isolate LIF 2328, which showed high MICs for Itraconazole, Voriconazole, and Posaconazole, did not present any mutations in the CYP51A and hmg1 genes. Surveyor Nuclease and microsatellite analysis were performed on 103 A. fumigatus isolates retrieved from 7 patients with cystic fibrosis. The Surveyor Nuclease analysis identified 11 isolates that probably carry mutations in the CYP51A gene, based on specific bands visualized in agarose gel, nevertheless, only 7 isolates present known CYP51A point mutations: F46Y, M127V, N248T, D225E, E427K, and N248K amino acid substitution. Regarding the genotyping assay, A. fumigatus isolates presented 3 distinct clonal complexes. Although the presence of these clonal complexes, the patients analyzed had no contact with each other, the only confirmed contact occurred in the hospital environment (Pneumology Outpatient Clinic of HC-UNICAMP). Further studies are necessary to understand the epidemiology and heterogeneity of A. fumigatus, as well as the elucidation of other mechanisms directly involved in its resistance to azoles, making surveillance essential, as it was proven to be an important emerging pathogen causing infections in our institutionDoutoradoPatologia ClínicaDoutora em CiênciasCAPES001[s.n.]Schreiber, Angélica Zaninelli, 1965-Lopes, Ariane Fidelis BussoVelho, Paulo Eduardo Neves FerreiraGoldman, Gustavo HenriqueAlmeida Junior, João Nóbrega deUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Faculdade de Ciências MédicasPrograma de Pós-Graduação em Ciências MédicasUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASPontes, Laís, 1992-20232023-06-15T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf1 recurso online (118 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/12017PONTES, Laís. Estudo de isolados sequenciais de Aspergillus fumigatus: igilância de resistência aos azólicos e caracterização molecular. 2023. 1 recurso online (118 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/12017. Acesso em: 3 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1346176porreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2023-08-29T15:46:34Zoai::1346176Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2023-08-29T15:46:34Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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