Brotamentos axonais em camundongos MDX e implicações na terapia genica da distrofia muscular de Duchenne

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Martins, Airton José
Data de Publicação: 2002
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1591665
Resumo: Orientadores: Humberto do Santo Neto, Maria Julia Marques
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spelling Brotamentos axonais em camundongos MDX e implicações na terapia genica da distrofia muscular de DuchenneJunção neuromuscularDistrofiaProteinas muscularesAxôniosOrientadores: Humberto do Santo Neto, Maria Julia MarquesDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A Distrofia muscular de Duchenne (DMD) é a forma mais comum e a mais devastadora das distrofias musculares. É causada pela mutação do gene responsável pela expressão da distrofina, uma proteína estrutural do sarcolema, a membrana celular das fibras musculares esqueléticas. A ausência dessa proteína leva a uma instabilidade sarcolemal que termina em necrose da fibra muscular. As fibras necróticas perdem a capacidade regenerativa fazendo com que o tecido muscular seja substituído por tecido fibroso. O comprometimento muscular inicia-se pelos membros inferiores e progride até atingir os músculos respiratórios, o que ocorre geralmente ao redor dos 20 anos de idade, quando os pacientes invariavelmente vão a óbito. Atualmente acredita-se que a cura efetiva da doença poderá ser feita com a terapia gênica que pode ser feita de duas formas. Uma delas consiste em fazer com que as fibras musculares já existentes passem a expressar distrofina e a outra em gerar novas fibras musculares que expressem distrofina. O sucesso dessas terapias depende do restabelecimento funcional das novas fibras musculares e das pré-existentes, cuja inervação deve ter sido perdida durante o momento em que sofreu o primeiro ciclo de degeneração. Por sua vez, a capacidade de reinervação depende exclusivamente da capacidade dos axônios gerarem brotamentos axonais. A simples presença de fibras musculares em degeneração e em regeneração deve atuar como fator estimulador de brotamentos axonais. Entretanto, dados da literatura mostram que em pacientes portadores de DMD, bem como em camundongos da linhagem mdx, o modelo experimental para o estudo da DMD, não ocorre brotamentos axonais. O objetivo deste trabalho foi examinar a capacidade de axônios de camundongos emitirem brotamentos axonais. Foram empregadas duas linhagens de camundongos, mdx e C57BL/10, cada uma delas foi examinada de duas formas: sem nenhum tratamento e com esmagamento do nervo que teve por objetivo induzir a emissão de brotamentos nervosos. Para tal, os animais foram anestesiados com injeção intraperitoneal de virbaxyl/ftancotar e o nervo para o músculo estemomastoideo esquerdo esmagado com pinça de relojoeiro. Oito dias após o esmagamento os animais foram anestesiados, perfundidos com paraformoldeido por via intracardíaca, e os músculos estemomastoídeos direito e esquerdo retirados para marcação dos receptores de acetilcolina e dos axônios pré-terminais e terminais. Isto foi realizado com o uso de a-bungarotoxina conjugada à rodamina e anticorpo monoclonal para filamentos nervosos, respectivamente. Os músculos foram examinados através da microscopia confocal de fluorescência. Nossas observações mostraram que em músculos de camundongos mdx, que não sofreram esmagamento do nervo, portanto que representa o que ocorre durante o curso normal da distrofia muscular, não houve aumento dos brotamentos axonais do tipo nodal, mas houve aumento significativo dos brotamentos extra e intraterminais, comparados aos camundongos C57BL/10. Por sua vez, quando estimulados pelo esmagamento do nervo, os brotamentos do tipo nodal e extraterminal, mas não aqueles intraterminais, estiveram presentes na mesma intensidade dos camundongos não distróficos. Essas observações permitem concluir que, embora durante o curso normal da doença não ocorra brotamento nodal, os axônios dos camundongos mdx são capazes de emitirem brotamentos extra e intraterminais. Considerando-se que a inervação de novas fibras musculares depende mais de brotamentos nodais, os quais podem propagar-se por maiores distâncias dentro de um mesmo músculo, é possível que as novas terapias de transplantes de mioblastos e de células tronco indiferenciadas apresentem menor possibilidade de sucesso que aquelas que consistem na transformação das fibras musculares pré-existentes, que não possuem distrofina em fibras distrofina positivas, já que sua inervação estaria garantida pela presença de brotamentos extraterminais e especialmente intraterminaisAbstract: Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is characterized by deficiency of dystrophin, a component of the muscle fiber membrane. The absence of dystrophin leads to muscle fiber degeneration, resulting in progressive muscle weakness. Cell mediated therapy aimed to restore dystrophin expression by fusing transplanted cells into original dystrophic fibers or by forming new dystrophin positive fibers. Thus, the success of cell therapy depends, among other factors, on muscle fiber reinnervation, which in turn depends on the ability of host axons to sprout. It is accepted that sprouts are induced in the presence of degenerating and regenerating muscle fibers. Since muscle fiber degeneration-regeneration is observed in DMD, as well as in the mdx mice, the animal model of DMD, the frequency of sprouts would be expected to be higher in dystrophic than in normal muscles. However, no axonal sprouts have been observed in muscles of DMD and mdx mice. In the present, we investigated whether intramuscular nerve bundles and motor terminals of mdx mice keep their ability to sprout after a nerve crush lesion. The sternomastoid muscles of adult (5-6 months) mdx mice (n=5) and C57Bl/10 controls (n=5) had their acetylcholine receptors and nerve terminals labelled with rhodamine-alpha-bungarotoxin and anti-neurofilament-IGgfluorescein, respectively, for confocal microscopy observation. Additional mdx (n=5) and C57Bl/10 (n=5) had the nerve to the left STN muscle crushed and 8 days later AChRs and nerve terminals were labelled and viewed the same way. Nerve terminal distribution in the mdx was seen as thin filaments with bulbs at their tips, which were in apposition to fainter central areas in the islands of receptors, being suggested that they represent intra-terminal sprouts, seen in about 90% of the endplates viewed of normal and crushed mdx mice. In crushed-mdx mice, extra-terminal sprouts were seen in 73%, while in crushed controls sprouts were present in about 41 % of the endplates. In conclusion, these findings demonstrate that mdx nerve terminals are able to sprout when a second stimulus, such as nerve lesion (in addition to muscle degeneration-regeneration) is present and this response can be of major relevance to the success of cell mediated-therapy to treat DMDMestradoAnatomiaMestre em Biologia Celular e Estrutural[s.n.]Santo Neto, Humberto, 1953-Marques, Maria Julia, 1961-Rodrigues, Antonio de CastroCampos, Gerson Eduardo RochaUniversidade Estadual de Campinas. Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação não informadoUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASMartins, Airton José20022002-02-19T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf69p. : il.(Broch.)https://hdl.handle.net/20.500.12733/1591665MARTINS, Airton José. Brotamentos axonais em camundongos MDX e implicações na terapia genica da distrofia muscular de Duchenne. 2002. 69p. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1591665. Acesso em: 14 mai. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/227734porreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2017-11-13T10:26:45Zoai::227734Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2017-11-13T10:26:45Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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