Caracterização da Hsp90 de Aedes aegypti e seus interatores SGT e complexo R2TP

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Quel, Natália Galdi, 1989-
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1242
Resumo: Orientador: Carlos Henrique Inácio Ramos
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Um conjunto de co-chaperonas da Hsp90 possuem um ou mais domínios TPR (tetratricopeptide repeat), os quais interagem com o motivo MEEVD no C-terminal da Hsp90. Entre as interatoras de Hsp90, neste trabalho foram caracterizadas estrutural e funcionalmente a SGT (Small glutamine-rich TPR-containing protein), que participa da translocação de proteínas ancoradas em membranas, e o complexo R2TP (Rvb1-Rvb2-Tah1/RPAP3-Pih1/Pih1D1), o qual está envolvido na montagem e estabilização de complexos que participam de vários processos biológicos essenciais para a célula e interage com a Hsp90 através da subunidade Tah1/RPAP3 (RNA polymerase II associated protein 3) – ambos de Aedes aegypti. As proteínas foram expressas em E. coli e purificadas com alto grau de pureza. Foram avaliados a estrutura secundária, estabilidade térmica e os parâmetros hidrodinâmicos das proteínas. Hsp90, SGT e Rvb1/Rvb2 foram também analisadas por espalhamento de raios-X a baixo ângulo. Finalmente, foram realizados experimentos de caracterização funcional e de interação entre as proteínas. A Hsp90 de Aedes aegypti apresentou atividade ATPásica com eficiência catalítica de 5,51 x 10-4 min-1 µM-1, condizente com suas ortólogas. Além disso, manteve um estado conformacional aberto durante todo o ciclo de ATPase, semelhante à Hsp90 humana e diferindo das Hsp90 de E. coli e levedura. Ainda, mostramos pela primeira vez que Hsp90 tem sua expressão aumentada em células de Aedes albopictus expostas a choque térmico, condizente com uma proteína requerida em situações de estresse. A SGT de Aedes aegypti mostrou ser uma proteína dimérica, não esférica e semelhante à SGT humana, mas diferente das SGTs de Leishmania braziliensis e de levedura. Interessantemente, demonstramos que mesmo na ausência da região C-terminal, a SGT de Aedes aegypti mantém uma estrutura globular, diferentemente do sugerido para a SGT humana. Finalmente, para as proteínas componentes do complexo R2TP, observamos que as Rvbs compõem um heterododecâmero; RPAP3 mostrou-se majoritariamente monomérica, e Pih1D1 mostrou equilíbrio concentração-dependente entre monômero e dímero. Interessantemente, Pih1D1 apresentou-se estável, diferindo de suas ortólogas. Ainda, avançamos na reconstituição do complexo R2TP in vitro. A caracterização dessas proteínas (Hsp90, SGT e complexo R2TP) de Aedes aegypti é importante pois pode contribuir para o entendimento do sistema de controle de qualidade de proteínas neste organismo, vetor de doenças tão importantes no contexto nacionalAbstract: Proteostasis is maintained by the protein quality control system, constituted by molecular chaperones and the proteasome. Among these chaperones, Hsp90 is essential for cell growth, having a role in protein folding and regulation of signaling proteins. Hsp90’s activity is modulated by its co-chaperones, which influences its ATPase cycle and gives specificity. A group of Hsp90’s co-chaperone involves TPR-containing proteins, that interact with the MEEVD motif localized in the C-terminus of Hsp90. In this work, Hsp90’s interactors were structurally and functionally characterized: SGT (Small glutamine-rich TPR-containing protein), that participates of the translocation of tail-anchored proteins, and R2TP complex (Rvb1-Rvb2-Tah1/RPAP3-Pih1/Pih1D1), which is involved in the assembly and stabilization of complexes associated with several essential processes and interacts with Hsp90 via Tah1/RPAP3 (RNA polymerase II associated protein 3) – both from Aedes aegypti. Proteins were expressed in E. coli and purified with high purity and their secondary structure, thermal stability and hydrodynamic parameters were determined. Hsp90, SGT and Rvb1/Rvb2 were also studied by small angle X-ray scattering. Finally, functional and interaction experiments were conducted. Aedes aegypti Hsp90 showed low ATPase activity, which is in good agreement with that of its orthologues. Furthermore, it maintained an open conformational state during the entire ATPase cycle, similar to human Hsp90 but different from E. coli and yeast Hsp90. Moreover, it was observed an increase in Hsp90 expression upon heat-treatment, which is in good agreement with a protein that is required for this type of stress. Aedes aegypti SGT was a dimer with a non-spherical shape and similar to the human SGT, but different from Leishmania braziliensis and yeast SGTs. Surprisingly, even deleted from its C-terminus, SGT maintained its globular structure, which is different from the suggested for human SGT. Finally, Rvbs were shown as a heterododecamer, RPAP3 was mainly a monomer and Pih1D1 was in a concentration-dependent equilibrium among monomer and dimer. Unexpectedly, Pih1D1 was found to be stable, different from its orthologues. Additionally, we showed evidence of the in vitro assemble of the Aedes aegypti R2TP complex. The characterization of these proteins (Hsp90, SGT and R2TP) is important because it may contribute to the comprehension of the protein quality control system in Aedes aegypti, which is a vector of many diseasesDoutoradoBioquímicaDoutora em Biologia Funcional e MolecularFAPESP2014/25967-4CAPES88887.137523/2017-00[s.n.]Ramos, Carlos Henrique Inacio, 1967-Oliveira, Juliana Ferreira deSmetana, Juliana Helena CostaFarah, Shaker ChuckWerneck, Claudio ChrysostomoUniversidade Estadual de Campinas. Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Biologia Funcional e MolecularUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASQuel, Natália Galdi, 1989-20192019-08-29T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf1 recurso online (156 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1242QUEL, Natália Galdi. Caracterização da Hsp90 de Aedes aegypti e seus interatores SGT e complexo R2TP. 2019. 1 recurso online (156 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1242. Acesso em: 15 mai. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1233092Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDFporreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2021-11-24T16:44:29Zoai::1233092Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2021-11-24T16:44:29Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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