Expressão, purificação e caracterização de uma Hsp70 citosólica de "Aedes aegypti"

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Amaro, Bárbara Cristina Trainotti, 1994-
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/17465
Resumo: Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos
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spelling Expressão, purificação e caracterização de uma Hsp70 citosólica de "Aedes aegypti"Expression, purification and characterization of a cytosolic Hsp70 from "Aedes aegypti"Chaperonas molecularesProteínas de choque térmico HSP70Aedes aegyptiMolecular chaperonesHSP70 heat-shock proteinsOrientador: Carlos Henrique Inacio RamosDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Proteínas são macromoléculas que, para exercerem suas funções biológicas, necessitam atingir uma estrutura tridimensional específica. Essa estrutura funcional, denominada estado nativo, é obtida através do enovelamento proteico. A incapacidade de atingir ou manter o correto enovelamento proteico resulta na perda de função e na formação de agregados proteicos, que estão associados ao desenvolvimento de doenças degenerativas. Para manter a homeostase proteica, ou proteostase, os organismos contam com um sistema chamado Controle de Qualidade Proteico (PQC, do inglês Protein Quality Control), que age sobre proteínas parcialmente enoveladas, encaminhando-as para vias de degradação ou reparando-as através das chaperonas moleculares. As chaperonas formam um grupo de proteínas acessórias estruturalmente diversas que atuam em uma rede dinâmica de colaboração. A Hsp70 é uma família de chaperonas altamente conservada entre os organismos. Dependentes de ATP, promovem o enovelamento de peptídeos desenovelados e são consideradas chaperonas de triagem, enviando suas proteínas-cliente para diferentes vias, incluindo autofagia e endocitose. Neste trabalho foi caracterizada uma Hsp70 citosólica de Aedes aegypti. Foram empregadas técnicas de espectropolarimetria de dicroísmo circular, fluorescência intrínseca do triptofano, cromatografia de filtração em gel acoplada a espalhamento de luz multi-ângulos (SEC-MALS) e espalhamento de luz quasielástico (QELS). O gene que codifica a Hsp70 foi clonado em vetor de expressão e a proteína foi produzida em sistema heterólogo (E. coli). A proteína foi obtida com alto grau de pureza e enovelada, tendo um conteúdo de aproximadamente 37% de hélices ? em sua estrutura secundária, se mantendo estável até cerca de 30 °C, quando na ausência de nucleotídeos, e até 35 °C, na presença de ATP. A Hsp70 recombinante apresentou-se majoritariamente como um monômero, sendo possível observar a presença de outras espécies oligoméricas, mas minoritárias, através de cromatografia de filtração em gel. Os ensaios de atividade ATPásica demonstraram que a Hsp70 é uma enzima ativa, capaz de realizar hidrólise intrínseca de ATP, com Km de 0,25 (± 0,06) mM e Kcat de 0,28 (±0,01) min-1, resultados condizente com os de suas ortólogas. Em ensaio com lisado de células de Aedes albopictus, a adição de AaHsp70 protegeu contra agregação induzida por estresse redutivo. A caracterização dessa proteína pode contribuir para o entendimento do Controle de Qualidade Proteico do mosquito Aedes aegypti, vetor de doenças importantes no contexto nacional, e, assim, permitir a busca por alvos moleculares relacionados diretamente à sobrevivência do organismo, gerando formas de combatê-loAbstract: Proteins are macromolecules that need to achieve a specific three-dimensional structure to perform their biological functions. This functional structure, named native state, is achieved through folding. The inability to achieve or maintain correct folding results in loss of function and in formation of aggregates, associated to the development of degenerative diseases. To maintain protein homeostasis, or proteostasis, organisms rely on a system named Protein Quality Control (PQC), which acts on misfolded proteins, directing them to degradation pathways or repairing them through molecular chaperones. Chaperones form a group of structurally diverse accessory proteins that act in a dynamic collaborative network. Hsp70 is a family of chaperones highly conserved among organisms. Dependent on ATP, they promote the folding of unfolded peptides, being considered the triage chaperones because of their role in sending their client proteins to different pathways, including autophagy and endocytosis. In this work, a cytosolic Hsp70 from Aedes aegypti was characterized. Circular dichroism spectropolarimetry, intrinsic tryptophan fluorescence, multi-angle light scattering (SEC-MALS) and quasielastic light scattering (QELS) gel filtration chromatography were used. The gene coding for Hsp70 was cloned into an expression vector and the protein was produced in a heterologous system (E. coli). The protein was obtained with a high degree of purity and folded, with 37% of ? helices in its secondary structure. It remained stable for up to about 30 °C in the absence of nucleotide, and 36 °C, in the presence of ATP. Recombinant Hsp70 presented itself mainly as a monomer, and the presence of other oligomeric species, although minor, was observed through gel filtration chromatography. To evaluate its function, ATPase activity assays were performed, which demonstrated that Hsp70 is an active enzyme, capable of performing intrinsic ATP hydrolysis. Km was calculated as 0.25 (± 0.06) mM and Kcat as 0.28 (± 0.01) min-1, and these results are in good agreement with those reported for Hsp70 orthologs. In an assay with Aedes albopictus cell lysate, addition of AaHsp70 resulted in protection against aggregation induced by reductive stress. The characterization of this protein can contribute to the understanding of the Protein Quality Control of Aedes aegypti mosquito, a vector of important diseases in the brazilian context, and, thus, allow the search for molecular targets directly related to the survival of this organismAbertoMestradoBioquímicaMestra em Biologia Molecular e MorfofuncionalCAPES88887.478910/2020-00 ; 88887.657618/2021-00[s.n.]Ramos, Carlos Henrique Inacio, 1967-Paula, Eneida deKobarg, JörgUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Biologia Molecular e MorfofuncionalUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASAmaro, Bárbara Cristina Trainotti, 1994-20232023-02-03T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf1 recurso online (104 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/17465AMARO, Bárbara Cristina Trainotti. Expressão, purificação e caracterização de uma Hsp70 citosólica de "Aedes aegypti". 2023. 1 recurso online (104 p.) Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/17465. Acesso em: 3 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1384692Cover: https://repositorio.unicamp.br/capa/capa?codigo=1384692Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDFporreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2024-05-15T15:12:46Zoai::1384692Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2024-05-15T15:12:46Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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