Regulação do promotor SMyHC3 pelos receptores nucleares GR e COUP-TFII : um trabalho solo ou conjunto?

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Tambones, Izabella Luisa, 1995-
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/388
Resumo: Orientador: Ana Carolina Migliorini Figueira
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spelling Regulação do promotor SMyHC3 pelos receptores nucleares GR e COUP-TFII : um trabalho solo ou conjunto?Regulation of the SMyHC3 promoter by the nuclear receptors GR and COUP-TFII : a solo or cooperative work?Receptores nuclearesFator II de transcrição COUPReceptores de glucocorticoidesCoração - CrescimentoNuclear receptorsCOUP transcription factor IIReceptors, GlucocorticoidHeart - GrowthOrientador: Ana Carolina Migliorini FigueiraDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O receptor nuclear Chicken ovalbumin upstream promoter transcription fator II (COUP-TFII) é apontado como um importante elemento envolvido no desenvolvimento cardíaco. Sua participação nesse contexto consiste na regulação de genes específicos, como o gene da isoforma 3 da cadeia pesada de miosina (SMyHC3). O SMyHC3 é caracterizado como um gene átrio-específico em codornas, e seu promotor tem se mostrado essencial para a diferenciação das câmaras cardíacas em diferentes espécies. Estudos in vivo e in silico revelaram que sua atividade átrio-específica é controlada via um elemento complexo de resposta a receptores nucleares (ECRRN) situado em sua região promotora. Esse ECRRN possui três sítios putativos de ligação dos NRs, denominados genericamente como A, B e C. Análises celulares revelaram que COUP-TFII é o principal candidato a regulação do promotor do gene SMyHC3, e sugerem que sua atividade regulatória é desempenhada em cooperação com os receptores de andrógenos (AR) e de glicocorticoides (GR). O objetivo deste trabalho visou avaliar a interação do AR, GR e COUP-TFII entre si e com o ECRRN buscando compreender o papel desses receptores frente a regulação do promotor do SMyHC3 no desenvolvimento cardíaco. Em razão da baixa quantidade proteíca obtida para o AR durante a execução deste projeto, esse receptor não foi incluído nas análises aqui apresentadas. Dessa forma, os ensaios de anisotropia de fluorescência mostraram uma maior afinidade do COUP-TFII pelo ECRRN, comparado ao GR. Também foram realizadas medidas de afinidade entre os NRs e os diferentes sítios putativos de ligação no ECRRN (A, B e C) e suas combinações (AB, BC e AC). Ambos receptores demonstraram preferência pelo mesmo sítio único (B) e de um sítio duplo cada (AB para COUP-TFII e BC para GR). Ensaios do tipo pull-down e de termoforese em microescala indicam que os receptores GR e COUP-TFII interagem fisicamente (Kd = 3,4 ± 0,7 µM), e podem formar um heterodímero atípico. Análises computacionais por docking e dinâmica molecular mostraram uma dupla interface possível entre a hinge e DBD (1) e os LBDs (2) de GR e COUP-TFII. Ensaios de transativação celular revelaram um crosstalk repressivo entre GR e COUP-TFII para a ativação dos elementos responsivos DR1 e do ECRRN. Ensaios de anisotropia de fluorescência utilizando ambos receptores sugerem que a transrepressão vista para o COUP-TFII ligado ao DR1 ocorre pelo acoplamento do GR. Finalmente, foi possível confirmar a ação conjunta de GR e COUP-TFII na regulação do ECRRN, evidenciando um crosstalk que pode ocorrer de maneira direta via acoplamento ou pela formação de um heterodímero GR/COUP-TFII ou indireta via modificação da cromatinaAbstract: The Chicken ovalbumin upstream promoter transcription factor II (COUP-TFII) is identified as an important element involved in the heart development context. Its participation in this biological context occurs by the regulation of specific genes, such as the slow myosin heavy chain (SMyHC3). The SMyHC3 is a quail atrium-specific gene, and its promoter is essential for the differentiation of cardiac chambers in different species. This atrium-specific activity is potentially regulated via a complex nuclear receptor response element (ECRRN) located in its promoter region. Cellular assays revealed that COUP-TFII is the main candidate for regulation of the SMyHC3 gene promoter, and suggest that its regulatory activity is performed in cooperation with androgen (AR) and glucocorticoid (GR) receptors. Thus, our objective was to evaluate the AR, GR and COUP-TFII interaction with each other and with the ECRRN seeking to understand the role of these receptors in the cardiac development regulation via the SMyHC3 promoter. Despite this, the AR protein was not included in our analyzes due to the difficulties in its production. Therefore, fluorescence anisotropy assays showed a greater affinity of COUP-TFII for ECRRN, compared to GR. Affinity measures were also performed between the receptors and the putative binding sites in the ECRRN (A, B, and C sites) and their combinations (AB, BC, and AC). Both receptors showed a preference for the same single site (B) and a double site (AB for COUP-TFII and BC for GR). Pull-down and microscale thermophoresis tests indicate that GR and COUP-TFII receptors interact physically (Kd = 3.4 ± 0.7 µM), and may form an atypical heterodimer. Computational analyzes by molecular docking and dynamics indicated a double interface between the hinge and DBD (1) and the LBDs (2) of GR and COUP-TFII. Cellular transactivation assays revealed a repressive crosstalk between GR and COUP-TFII in the regulation of DR1 and ECRRN responsive elements. Fluorescence anisotropy assays using both receptors and different response elements indicate that the transrepression between the NRs seen for the DR1 occurs by the coupling of GR in COUP-TFII. Finally, we confirm the crosstalk between GR and COUP-TFII in the regulation of the ECRRN. More specifically this crosstalk can occur directly, by coupling or the formation of the GR/COUP-TFII heterodimer or indirectly, via chromatin modificationMestradoFármacos, Medicamentos e Insumos para SaúdeMestra em CiênciasFAPESP2018/02481-0; 2019/13928-8CAPES001[s.n.]Figueira, Ana Carolina Migliorini, 1980-Benedetti, Celso EduardoMelo, Fernando Alves deUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Biociências e Tecnologia de Produtos BioativosUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASTambones, Izabella Luisa, 1995-20202020-08-05T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf1 recurso online (128 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/388TAMBONES, Izabella Luisa. Regulação do promotor SMyHC3 pelos receptores nucleares GR e COUP-TFII: um trabalho solo ou conjunto?. 2020. 1 recurso online (128 p.) Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/388. Acesso em: 3 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1231483Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDFporreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2021-11-11T14:44:56Zoai::1231483Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2021-11-11T14:44:56Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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