Prospecção e validação de efetores de Phyllosticta citricarpa (agente da mancha preta dos citros), P. citribraziliensis e P. capitalensis (endofíticos em citros) : Prospection and validation of effectors of Phyllosticta citricarpa (citrus black spot agent), P. citribraziliensis and P. capitalensis (citrus endophytic)

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Santos, Paulo José Camargo dos, 1988-
Data de Publicação: 2018
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1641295
Resumo: Orientador: Marcos Antônio Machado
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No entanto, patógenos como o fungo Phyllosticta citricarpa elevam o custo da produção, resultado dos gastos que são investidos para o controle da doença e que na maioria das vezes não são suficientes. A doença causada por P. citricarpa é conhecida como mancha preta dos citros (MPC), os principais prejuízos se dão por conta da queda prematura dos frutos no pomar, depreciação da fruta fresca no mercado in natura impossibilitando a comercialização com países da União Europeia por ser considerada uma doença quarentenária A1. O processo infeccioso de P. citricarpa e seu hospedeiro ainda não são claros, sabe-se que as lesões são limitadas ao flavedo e parecem estar associadas à defesa da planta frente ao patógeno. Outras duas espécies do gênero Phyllosticta, P. capitalensis e P. citribraziliensis são isoladas de plantas de citros assintomáticas, caracterizando-as como endófitas nesse hospedeiro. Os Microrganismos secretam proteínas efetoras a fim de modular o sistema de defesa do hospedeiro tornando-os susceptíveis, no entanto, uma vez que os efetores são reconhecidos pelo hospedeiro, podem desencadear imunidade e levar a uma resposta de hipersensibilidade (HR). O presente trabalho objetivou identificar genes candidatos a efetores (GCEs) nos genomas de P. citricarpa, P. capitalensis e P. citribraziliensis, avaliar a expressão dos genes selecionados frente a um sinal de citros e realizar a caracterização funcional pela expressão transiente em Nicotiana benthamiana. Para tais análises, inicialmente os genomas foram sequenciados, montados e analisados. Os resultados gerados mostraram que para a montagem de genomas o programa SPAdes foi o que apresentou melhores resultados, sendo que um genoma de 31 Mb com 388 contigs de P. citricarpa, um genoma de 32 Mb com 171 contigs para P. capitalensis e um genoma de 31 Mb com 488 contigs para P. citribraziliensis foram montados. A pipeline desenvolvida para a seleção de GCEs foi eficiente e um total de 37 GCEs tiveram a expressão avaliada, dos quais 18 GCEs foram induzidos na presença do extrato de albedo de laranja, 14 na presença do extrato de albedo de lima ácida tahiti e 3 foram induzidos na presença do D-Limoneno. O albedo de laranja foi então utilizado como sinal biológico para análise do transcriptoma total. O RNA-seq mostrou que P. capitalensis apresentou maior número de genes diferencialmente expressos (GDE) (3788), seguido por P. citricarpa (2689) e por último P citribraziliensis (1248). Dentro dos GDE, foi possível identificar 44, 27 e 12 GCEs (proteínas hipotéticas ou não anotadas) sendo induzidos por P. capitalensis, P. citricarpa e P. citribraziliensis. A caracterização funcional de 4 GCEs, em folhas de N. benthamiana mostrou que dois GCEs induziram HR após 72 e 96 horas: o gene Pcom01do patógeno P. citricarpa e o Pcapi04 do endofítico P. capitalensis. Os GCEs secretados pelas espécies do gênero Phyllosticta na presença do extrato de albedo devem ser melhores estudados a fim de identificar a função desses efetores no hospedeiro. Esse é o primeiro trabalho a identificar os mecanismos moleculares utilizados por P. citricarpa para infectar citros, e o avanço dessa pesquisa deve resultar em novas estratégias para um melhor controle da doença.Abstract: Brazilian citriculture has an outstanding position in the worldwide scenario, being the largest exporter of concentrated and non-concentrated juice, and also generating more than 200 thousand jobs and raising the human development index in cities where citriculture is present. However, pathogens such as the fungus Phyllosticta citricarpa raise the cost of production, a result of the expenses that are invested to control the disease and that in most cases are not enough. Phyllosticta citricarpa affects the main commercial varieties of Citrus and related genera, used in the production of fruits and causes citrus black spot (CBS). The disease is responsible for the premature loss of fruit, depreciation of fresh fruit and makes it impossible to trade with European Union countries because it is considered a quarantine disease A1. The infectious process of P. citricarpa and its host are still unclear. Lesions are always limited to flavedo and appear to be associated with the defense of the plant against the pathogen. Citrus is a host of P. capitalensis, P. citribraziliensis (endophytic) and P. citricarpa (pathogenic). The objective of this study was to identify candidate effectors genes (CEGs) of P. citricarpa, P. capitalensis and P. citribraziliensis in the genome, evaluate the expression of the selected genes against a citrus signal, and perform the functional characterization by transient expression in Nicotiana benthamiana. The results showed that the assembly of genomes by the SPAdes software had the best result; 31 Mb genome with 388 contigs for P. citricarpa, 32 Mb genome with 171 contigs for P. capitalensis and 31 Mb genome with 488 contigs for P. citribraziliensis were assembled. The pipeline developed for the selection of CEGs was efficient and 37 CEGs had the expression evaluated. 18 CEGs were induced in the presence of the orange albedo extract, 14 in the presence of the tahiti acid albedo extract and 3 were induced in the presence of D-Limonene. The orange albedo was then used as a biological signal for analysis of the total transcriptome. The analysis of RNA-seq showed that P. capitalensis was the fungus that presented the highest number of genes differentially expressed in the presence of the albedo extract (3788), followed by P. citricarpa (2689) and finally P citribraziliensis (1248). It was possible to identify 44, 27 and 12 differentially expressed (hypothetical or non-annotated) candidate genes for P. capitalensis, P. citricarpa and P. citribraziliensis, respectively. The functional characterization of 4 GCEs in leaves of N. benthamiana showed that two GCEs induced HR after 72 and 96 hours: the Pcom01 gene of the pathogen P. citricarpa and the Pcapi04 of the endophytic P. capitalensis. GCEs secreted by species of the genus Phyllosticta in the presence of albedo extract should be better studied in order to identify the function of these effectors in the host. This is the first work to identify the molecular mechanisms used by P. citricarpa to infect citrus, and the advancement of this research should result in new strategies for better control of the disease.DoutoradoBioquímicaDoutor em Biologia Funcional e MolecularCAPES001[s.n.]Machado, Marcos Antonio, 1951-Vincentz, Michel Georges AlbertRamos-González, Pedro LuisFreitas-Astúa, JulianaColetta-Filho, Helvecio DellaUniversidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Biologia Funcional e MolecularUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASSantos, Paulo José Camargo dos, 1988-20182018-08-30T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf1 recurso online ( 96 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1641295SANTOS, Paulo José Camargo dos. Prospecção e validação de efetores de Phyllosticta citricarpa (agente da mancha preta dos citros), P. citribraziliensis e P. capitalensis (endofíticos em citros): Prospection and validation of effectors of Phyllosticta citricarpa (citrus black spot agent), P. citribraziliensis and P. capitalensis (citrus endophytic) . 2018. 1 recurso online ( 96 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1641295. Acesso em: 3 set. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1164473Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDFporreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2021-05-10T13:39:41Zoai::1164473Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2021-05-10T13:39:41Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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