Otimização de protocolo para análise proteômica dos fluidos lacrimais em pacientes com lesões orais potencialmente malignas e câncer de boca

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Santos, Erison Santana dos, 1992-
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/82
Resumo: Orientador: Adriana Franco Paes Leme
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Entretanto, o processo de malignização dessas lesões ainda não é totalmente conhecido. Portanto, encontrar assinaturas moleculares que possam predizer quais lesões sofrerão malignização pode antecipar o diagnóstico dos pacientes com CEC oral e melhorar o prognóstico. A biópsia líquida, como os fluidos lacrimais, é uma alternativa promissora não invasiva para busca por essas assinaturas. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi otimizar um protocolo de coleta, extração e digestão de proteínas dos fluidos lacrimais na perspectiva de utilizar esse fluido na busca por assinaturas de malignização. Esse projeto foi realizado em duas etapas. Na primeira etapa, foi otimizado 12 protocolos em que as proteínas do fluido lacrimal de indivíduos saudáveis foram solubilizadas em agentes caotrópicos, solução de detergente, surfactante, agentes desnaturantes. As digestões com tripsina foram realizadas em solução ou em gel. As análises por meio de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS/MS) foram realizadas utilizando-se pelo menos dois gradientes de cromatografia líquida em diferentes espectrômetros de massas. O processamento dos dados para identificação e quantificação de proteínas foi realizado utilizando os softwares MaxQuant ou Mascot. As proteínas foram analisadas quanto: ao compartilhamento entre grupos pelo InteractiVenn; à localização dessas proteínas pelo The Human Protein Atlas e Uniprot e Uniprot; à predição de peptídeo sinal e hélice transmembrana pelo SignaIP, TMHMM; ao enriquecimento de processos biológicos pelo Enrichr e à interação proteína-proteína pelo String. Entre os protocolos testados, o que apresentou o melhor resultado foi o protocolo nomeado de P11, no qual as proteínas foram solubilizadas em ureia, digeridas em solução, com dupla digestão por tripsina, e os peptídeos resultantes foram separados em gradiente total de cromatografia líquida de 60 minutos e analisados no espectrômetro de massas LTQ Orbitrap Velos e a busca pelos peptídeos foi realizada utilizando o software MaxQuat. Nesse protocolo, 209 proteínas foram identificadas, 72 apresentaram presença de peptídeos sinal e 23 apresentaram preditores de hélice transmembrana. No protocolo P11, o processo biológico mais associado à essas proteínas foi a homeostase da retina, e as proteínas que apresentaram maior evidência de interação proteína-proteína foram as queratinas. Na segunda etapa, após definição do melhor protocolo, foram coletadas e preparadas amostras referentes à 90 pacientes com LO, LVP, CEC oral e pacientes saudáveis para posterior análise por meio de LC-MS/MS. Em resumo, este estudo apresenta pela primeira vez a otimização de protocolos para análise de proteínas dos fluidos lacrimais visando a busca por assinaturas moleculares de malignização para antecipar a progressão do câncer de bocaAbstract: Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the main histological type of mouth cancer. This neoplasm may arise from lesions known as potentially malignant oral disorders, such as oral leukoplakia (OL) and proliferative verrucous leukoplakia (PVL) that show a high frequency and potential for malignancy, respectively. However, the process of malignant transformation of these lesions is not completely understood. Therefore, the search for molecular signatures that may assist the early diagnosis and improve the prognosis of patients with oral cancer. Liquid biopsy, such as lacrimal fluids, is a promising non-invasive source of molecular signatures. This study aimed to optimize a protocol of collection, extraction, and digestion of proteins of tears to further search for molecular signatures of malignant transformation. This study was performed in two phases. Firstly, we tested 12 protocols in which the proteins of lacrimal fluid from healthy patients were solubilized in chaotropic agent, detergent, surfactant, denaturing agent.We performed in-solution and in-gel digestion. The liquid chromatography–mass spectrometry (LC-MS/MS) was performed using at least two gradients of liquid chromatography using different mass spectrometers. The data were analyzed using the softwares MaxQuant or Mascot, and InteractiVenn, The Human Protein Atlas, Uniprot, Enrichr, R-Studio, SignaIP, TMHMM and String. Among the tested protocols, the protocol named P11 outperformed the others. In this protocol, the proteins were solubilized in urea and submitted to in-solution trypsin digestion, with double digestion, and the resulting peptides were separated in a 60-min gradient of liquid chromatography in the LTQ Orbitrap Velos. This protocol identified 209 proteins, 72 presented signal peptides, and 23 presented predictors of a transmembrane helix. The biological process most associated with these proteins was retina homeostasis. The keratins presented the highest evidence of protein-protein interaction. In the second phase, we collected and prepared samples of lacrimal fluids from patients with OL, PVL, and OSCC and healthy patients for further analysis by LC-MS/MS. In summary, this study shows for the first time the optimization of a protocol for the analysis of lacrimal fluid proteins aiming the search for molecular signatures of malignant transformation to anticipate the progression to oral cancerMestradoPatologiaMestre em EstomatopatologiaCAPES0FAPESP2018/19922-9[s.n.]Leme, Adriana Franco Paes, 1977-Lopes, Ariane Fidelis BussoVargas, Pablo AgustinUniversidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de PiracicabaPrograma de Pós-Graduação em EstomatopatologiaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASSantos, Erison Santana dos, 1992-20202020-07-27T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf1 recurso online (139 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/82SANTOS, Erison Santana dos. Otimização de protocolo para análise proteômica dos fluidos lacrimais em pacientes com lesões orais potencialmente malignas e câncer de boca. 2020. 1 recurso online (139 p.) Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Piracicaba, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/82. Acesso em: 15 mai. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1230738Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDFporreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2021-11-05T15:49:39Zoai::1230738Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2021-11-05T15:49:39Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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