Estudos biossintéticos de produtos naturais microbianos inibidores do proteassomo

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Vieira, Bruna Domingues, 1989-
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/10096
Resumo: Orientador: Daniela Barretto Barbosa Trivella
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Os avanços no sequenciamento de genomas promoveram o desenvolvimento de ferramentas de mineração e a criação de bases de dados com informações de biossíntese de produtos naturais, facilitando a descoberta e a produção de novos fármacos. Neste estudo analisamos a via biossintética de produtos naturais peptídicos com farmacóforo epoxicetona inibidores do complexo proteassomo. A primeira parte do trabalho contemplou as etapas iniciais em estudos biossintéticos, a partir da bactéria marinha Streptomyces sp. BRA-346 isolada de ascídia brasileira e identificada como produtora de peptídeos epoxicetona inibidores do proteassomo. O genoma de BRA-346 recentemente sequenciado foi minerado, revelando um potencial biossintético não observado em condições laboratoriais. A bactéria BRA-346 foi então cultivada utilizando diferentes meios de cultura e eliciadores químicos para aumentar a produção de compostos epoxicetona e como tentativa de acessar os metabólitos de vias crípticas. Os metabólitos presentes nos diferentes extratos das culturas de BRA-346 foram então analisados por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas. Combinando a mineração de genomas com dados metabolômicos foi possível analisar os perfis metabólicos obtidos e avaliar as melhores condições para produção de inibidores do proteassomo e outros metabólitos crípticos de BRA-346. Um BGC candidato para produção dos peptídeos epoxicetonas foi minerado e apresentou um núcleo de genes biossintéticos homólogos aos BGCs de eponemicina (EPN) e TMC-86A (TMC). O BGC candidato foi clonado no organismo hospedeiro Streptomyces coelicolor M1146, visando a expressão heteróloga dos peptídeos epoxicetonas de BRA-346. O organismo recombinante foi capaz de produzir os produtos naturais TMC e EPN, juntamente com os intermediários biossintéticos dihidroTMC-86A (DH-TMC) e dihidroeponemicina (DHE), e diversos congêneres. Esses dados sugerem a plasticidade deste BGC de BRA-346, na produção de peptídeos epoxicetona, sendo este então denominado epn/tmc BGC. Além disto, estes resultados demonstram a viabilidade da produção de TMC e EPN em altas quantidades em laboratório, o que deve viabilizar futuros estudos com estes compostos e os novos análogos. A segunda parte deste estudo contemplou a etapa mais avançada de estudos biossintéticos na qual investigamos o mecanismo catalítico de enzimas da família Acil-Coenzima A Desidrogenase (ACAD) envolvidas na biossíntese do farmacóforo epoxicetona de inibidores peptídicos do proteassomo, como EPN e TMC. Foram realizadas análises in silico comparativas das ACADs homólogas: EpnF, EpxF, TmcF, ACAD7295 e MatG. Estas enzimas se destacaram por seu papel essencial nas vias de biossíntese dos inibidores do proteassomo contendo o farmacóforo epoxicetona, são sugeridas por participar de três etapas catalíticas e suas estruturas tridimensionais ainda não são conhecidas. Foi realizada a produção recombinante de EpnF, EpxF e MatG, além de mutantes e variantes truncadas. As enzimas produzidas foram submetidas a caracterização biofísica e bioquímica preliminar, e tentativas de cristalização. Este trabalho contribui na compreensão da biossíntese e regulação da via de produção de peptídeos epoxicetona em estreptomicetos e avança na caracterização de ACADs biossintéticasAbstract: The understanding of biosynthetic pathways has been a revolution on natural products studies, and it has applications in several fields of knowledge such as biocatalysis, drug discovery and development, chemical ecology, among others. Genome sequencing advances provided the development of genome mining tools and the creation of data bases containing information about natural products biosynthesis, facilitating the discovery and production of new drugs. In the present study we analyzed the biosynthetic pathway of proteasome inhibitors with epoxyketone pharmacophore produced by bacteria. The first step of the research included initial biosynthetic studies in which we evaluated the marine bacterium Streptomyces sp. BRA-346, an actinobacteria isolated from a Brazilian endemic tunicate identified as a producer of epoxyketone peptides proteasome inhibitors. The BRA-346 genome has been recently sequenced and mined, showing a biosynthetic potential not observed in laboratorial conditions. This bacterium was then cultivated using different culture medium composition and chemical elicitors to increase the epoxyketone peptides production, and as an attempt to access cryptical pathway metabolites. The metabolites extracted from BRA-346 cultures were analyzed by liquid chromatography coupled with mass spectrometer. Through the combining of genome mining with metabolomic it was possible to analyze the metabolic profiles obtained and evaluate the best conditions to produce epoxyketone peptides and other cryptic metabolites of BRA-346. A candidate BGC to produce epoxyketone peptides was mined, showing a biosynthetic genes core homologous to the BGCs of the proteasome inhibitors eponemycin (EPN) and TMC-86A (TMC). The candidate BGC was cloned into the host organism Streptomyces coelicolor M1146 aiming the heterologous expression of epoxyketone peptides of BRA-346. The recombinant organism was able to produce TMC and EPN natural products, as well as dihydroTMC-86A (DH-TMC) and dihydroeponemycin (DHE) biosynthetic intermediates, and several congeners. This data suggests the plasticity of BRA-346 BGC to produce epoxyketone peptides, named epn/tmc BGC. Furthermore, such results show the feasibility of producing TMC and EPN in high quantities in vitro, which should enable future studies with these compounds and new analogues. The second part of this research analyzed the most advanced stage of biosynthetic studies, in which we investigated the catalytic mechanism of enzymes of the acyl-Coenzyme A dehydrogenase (ACAD) family involved in the biosynthesis of the epoxyketone pharmacophore of proteasome inhibitors, such as EPN and TMC. Comparative in silico analyzes of the homologous ACADs EpnF, EpxF, TmcF, ACAD7295, and MatG were performed. These enzymes stood out for their essential role in the biosynthetic pathways of proteasome inhibitors containing the epoxyketone pharmacophore. They are believed to be involved in three catalytic steps, but their three-dimensional structures are still unknown. Recombinant production of EpnF, EpxF and MatG was performed, as well as mutants and truncated variants. The enzymes produced were submitted to preliminary biophysical and biochemical characterization, followed by crystallization attempts. The present study contributes to the understanding of the biosynthesis and regulation of the epoxyketone peptides production pathway in streptomycetes, furthering the characterization of biosynthetic ACADsDoutoradoCiências Farmacêuticas - Insumos Farmacêuticos Naturais, Biotecnológicos e SintéticosDoutora em CiênciasCNPQ870001/2017-5[s.n.]Trivella, Daniela Barretto Barbosa, 1980-Crnkovic, Camila ManoelAngolini, Célio Fernando FigueiredoMurakami, Mário TyagoLima, André Oliveira de SouzaUniversidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências FarmacêuticasPrograma de Pós-Graduação em Ciências FarmacêuticasUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASVieira, Bruna Domingues, 1989-20212021-11-30T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf1 recurso online (171 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/10096VIEIRA, Bruna Domingues. Estudos biossintéticos de produtos naturais microbianos inibidores do proteassomo. 2021. 1 recurso online (171 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/10096. Acesso em: 15 mai. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1328995porreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2023-06-05T11:14:48Zoai::1328995Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2023-06-05T11:14:48Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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