Engenharia metabólica e evolução de "Saccharomyces cerevisiae" visando a fermentação de arabinose e xilose

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Costa, Paulo Emílio dos Santos, 1994-
Data de Publicação: 2022
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/12158
Resumo: Orientador: Leandro Vieira dos Santos
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O emprego de abordagens racionais associadas a estratégias de evolução adaptativa permite a identificação de novos metabolismos e alvos genéticos que podem potencializar o consumo dessas pentoses. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo a construção de uma cepa industrial fermentadora de arabinose e xilose, bem como a identificação de bases genéticas fixadas durante procedimentos de evolução adaptativa e responsáveis por otimizar a conversão de C5. Inicialmente, cassetes de expressão gênica contendo a via metabólica de conversão de arabinose foram construídos utilizando abordagens de biologia sintética, e estavelmente integrados no genoma de uma cepa industrial fermentadora de xilose, dando origem a linhagem base PEY-AX5. Somente com o design racional, a linhagem construída não era capaz de crescer em arabinose como fonte única de carbono. Estratégias de evolução adaptativa foram aplicadas e após 65 e 190 gerações foi observado um rápido crescimento em meio contendo arabinose. A população foi capaz de fermentar a totalidade da arabinose, alcançando um rendimento de conversão de 0,42 g etanol/ g arabinose. Também foi observado o co-consumo de xilose e arabinose em fermentações contendo a mistura dos açúcares. O sequenciamento genômico será realizado nas populações evoluídas para a identificação de SNPs e CNVs fixados nas populações durante a evolução e associados com o aumento da capacidade fermentativa de arabinose. Em um projeto paralelo, foram avaliados o efeito de duas mutações benéficas para a conversão de xilose. Os genes avaliados foram ZWF1, evolvido na fase oxidativa da via das pentoses fosfato, e o gene CLN3, importante ciclina do ciclo celular, além de interações epistáticas com o gene ISU1, envolvido na formação de clusteres Fe-S. Mutantes knockout e com a inserção de SNPs foram introduzidos em uma cepa fermentadora de xilose usando o sistema CRISPR-Cas9. Os ensaios fermentativos demostraram efeitos positivos na deleção dos genes, além de interação positiva entre os genes ZWF1 e ISU1, com o mutante duplo consumindo 50 g/L de xilose em menos de 32 horas e rendimento de 0,47 g de etanol/ g xilose. Com os resultados gerados no presente trabalho, conseguimos desenvolver leveduras capazes de consumir de forma eficiente a L-arabinose, além de promover o co-consumo dos açúcares C5. Após sequenciamento genômico, seremos capazes de identificar novos alvos e metabolismos responsáveis pela eficiente conversão de pentoses. Por fim, validamos os genes ZWF1 e CLN3 como novos alvos com potencial biotecnológico para conversão de xilose. O conjunto das mutações identificadas pode ser utilizado em abordagens racionais de engenharia metabólica, desenvolvendo plataformas microbianas eficientes visando a conversão de resíduos agroindustriais em bioprodutosAbstract: The use of plant biomass for the sustainable production of bioproducts is a promising alternative to reduce the use of fossil sources and mitigate the environmental impacts resulting from their consumption. However, the metabolic limitation of the yeast Saccharomyces cerevisiae in consuming the five-carbon (C5) sugars derived from plant biomass, such as the pentoses xylose and arabinose, is one of the main bottlenecks for an economically feasible production of lignocellulose-based products. The rational microbial design associated with adaptive evolution strategies allowed the identification of novel metabolisms and genetic targets that boost the consumption of these pentoses. In this context, the goal of the present work is the construction of an industrial yeast arabinose and xylose-fermenting strain, as well as the identification of genetic bases fixed during adaptive evolution strategies and responsible for optimizing the conversion of C5. Initially, gene expression cassettes containing the arabinose metabolic pathway were designed and constructed using synthetic biology approaches, and stably integrated into the genome of an industrial xylose-fermenting strain, resulting in the yeast cell PEY-AX5. The initial strain was not able to grow on arabinose as the sole source of carbon. Adaptive evolution strategies were applied and after 65 and 190 generations, rapid growth was observed in medium containing arabinose. The population was able to completely ferment the arabinose, reaching a conversion yield of 0.42 g ethanol/g arabinose. Co-consumption of xylose and arabinose was also observed in fermentations containing the mixture of sugars. Genomic sequencing will be performed on evolved populations to identify SNPs and CNVs fixed in populations during evolution and associated with the increased arabinose fermentative capacity. In a parallel project, the effect of two beneficial mutations on xylose conversion was evaluated. The genes evaluated were ZWF1, involved in the oxidative phase of the pentose phosphate pathway, and the CLN3 gene, an important cyclin in the cell cycle, in addition to epistatic interactions with the ISU1 gene, involved in the assembling of Fe-S clusters. Gene deletions and SNPs were introduced into a xylose-fermenting strain using the CRISPR-Cas9 system. Fermentation assays showed positive effects on gene deletion, in addition to a positive interaction between the ZWF1 and ISU1 genes, with the double mutant consuming 50 g/L of xylose in less than 32 hours and yielding 0.47 g of ethanol/g of xylose. With the results produced in the present work, we were able to develop yeasts capable of efficiently consuming L-arabinose, in addition to promoting the co-consumption of C5 sugars. After genomic sequencing, we will be able to identify novel targets and metabolisms responsible for the efficient conversion of pentoses. Finally, we were able to validate the ZWF1 and CLN3 genes as new targets with biotechnological potential for xylose conversion. The set of mutations identified can be used in rational metabolic engineering approaches, designing efficient microbial platforms to convert agro-industrial residues into renewable bioproductsMestradoGenética de MicroorganismosMestre em Genética e Biologia MolecularFAPESP2019/069424-4[s.n.]Santos, Leandro Vieira dos, 1982-Corrêa, Thamy Lívia RibeiroJacobus, Ana PaulaUniversidade Estadual de Campinas. Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Genética e Biologia MolecularUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASCosta, Paulo Emílio dos Santos, 1994-20222022-04-20T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdf1 recurso online (84 p.) : il., digital, arquivo PDF.https://hdl.handle.net/20.500.12733/12158COSTA, Paulo Emílio dos Santos. Engenharia metabólica e evolução de "Saccharomyces cerevisiae" visando a fermentação de arabinose e xilose. 2022. 1 recurso online (84 p.) Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/12158. Acesso em: 15 mai. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/1346795Requisitos do sistema: Software para leitura de arquivo em PDFporreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2023-09-04T15:51:31Zoai::1346795Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2023-09-04T15:51:31Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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